楊先碧

自古以來(lái)，人類的好奇心不斷地推動(dòng)著社會(huì)進(jìn)步。在好奇心的驅(qū)使下，人類不僅把目光投向數(shù)萬(wàn)光年之外的星空，也把視野推進(jìn)到微納尺寸的微觀世界。對(duì)生命的細(xì)節(jié)看得越仔細(xì)，就越有利于人們知曉生命的本質(zhì)。正是在這樣的背景下，顯微技術(shù)成為熱門的科研領(lǐng)域，相關(guān)科學(xué)家也多次榮獲諾貝爾獎(jiǎng)。瑞士科學(xué)家雅克·杜波謝、美國(guó)科學(xué)家阿希姆·弗蘭克、英國(guó)科學(xué)家理查德·亨德森，也因在冷凍顯微電鏡領(lǐng)域的突出貢獻(xiàn)，而分享了2017年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。

顯微鏡放大微小樣品

如何看清微觀世界里的小東西？我們首先想到的就是使用顯微鏡。原始的光學(xué)顯微鏡是一個(gè)高倍率的放大鏡。據(jù)記載，在1610年前，意大利物理學(xué)家伽利略己制作過(guò)復(fù)式顯微鏡，并觀察了昆蟲(chóng)的復(fù)眼。這是一種己具目鏡、物鏡和鏡簡(jiǎn)等裝置，并被固定在支架上的顯微鏡。

1665年前后，英國(guó)生物學(xué)家胡克發(fā)明了比較類似我們現(xiàn)在學(xué)校實(shí)驗(yàn)室里用的顯微鏡，并通過(guò)這臺(tái)顯微鏡看到了軟木中網(wǎng)格狀的結(jié)構(gòu)，胡克稱之為“細(xì)胞”。這是人類歷史上最偉大的發(fā)現(xiàn)之一，大大推動(dòng)了生物學(xué)的發(fā)展。

與胡克同時(shí)代的荷蘭科學(xué)家列文虎克對(duì)顯微技術(shù)的推動(dòng)做出了主要貢獻(xiàn)。他一生制作了不少于247架顯微鏡，觀察了許多細(xì)菌、原生動(dòng)物和動(dòng)植物組織，是第一個(gè)用顯微鏡做科學(xué)觀察的人。到18世紀(jì)，顯微鏡已有許多改進(jìn)，應(yīng)用比較普遍，已作為一種商品進(jìn)行生產(chǎn)。

然而，傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡不能無(wú)限制地放大微小的樣品，它會(huì)受到“阿貝原則”的限制。什么是“阿貝原則”？1873年，德國(guó)顯微鏡學(xué)家恩斯特·阿貝通過(guò)計(jì)算發(fā)現(xiàn)，由于光波相互干擾的原因，光學(xué)顯微鏡不能無(wú)限度地放大微小樣品，最多只能“看到”光波波長(zhǎng)一半的樣品，即尺寸不小于200納米的樣品。這就是有名的“阿貝原則”，200納米也被稱為光學(xué)顯微鏡的“繞射極限”。

如何看清生物大分子

光學(xué)顯微鏡只能看到細(xì)胞或細(xì)胞內(nèi)較大的細(xì)胞器，要看到100納米以下的生物大分子就不太可能了。生物大分子是指生物體細(xì)胞內(nèi)存在的蛋白質(zhì)、核酸、多糖等大分子。每個(gè)生物大分子內(nèi)有幾千到幾十萬(wàn)個(gè)原子，分子量從幾萬(wàn)到幾百萬(wàn)以上。生物大分子的結(jié)構(gòu)很復(fù)雜，但其基本的結(jié)構(gòu)單元并不復(fù)雜。蛋白質(zhì)分子是由氨基酸分子以一定的順序排列成的長(zhǎng)鏈。氨基酸分子是大部分生命物質(zhì)的組成材料，不同的氨基酸分子有好幾十種。生物體內(nèi)的絕大多數(shù)酶就屬于蛋白質(zhì)，是生物體維持正常代謝功能所不可缺少的。

為了突破光學(xué)顯微鏡的局限，弄清楚生物大分子的構(gòu)造，科學(xué)家想了很多辦法。有的科學(xué)家制造出超高分辨率光學(xué)顯微鏡，其實(shí)是讓生物分子發(fā)熒光，這種方法的使用有一些局限性。因?yàn)樗怯眉す鈦?lái)激發(fā)生物大分子，這樣照射時(shí)間不能太長(zhǎng)，否則可能殺死生物大分子。但是，照射時(shí)間短又可能會(huì)失去一些重要信息。而且，超高分辨率光學(xué)顯微鏡最高只能達(dá)到10納米的分辨率，仍然無(wú)法看清分子內(nèi)部的精細(xì)結(jié)構(gòu)。

還有一種很常用的方法是“x射線晶體衍射”技術(shù)。之前，亨德森就非常喜歡用這種技術(shù)來(lái)研究生物大分子。但是，這種技術(shù)也有很明顯的局限性，那就是這種方法需要首先獲取純度很高的生物大分子晶體。而不少生物大分子結(jié)晶情況不理想，甚至有的就不能結(jié)晶。膜蛋白就是一個(gè)很大的挑戰(zhàn)。對(duì)于大多數(shù)的生物，膜蛋白占了蛋白質(zhì)組的20%～30%，藥物靶點(diǎn)的達(dá)到40%以上。然而，這些分子的結(jié)構(gòu)很少能通過(guò)X射線晶體學(xué)來(lái)闡明。

科學(xué)家還想到的方法是用電子顯微鏡（簡(jiǎn)稱電鏡）。電鏡的分辨率的確很高，可以達(dá)到納米級(jí)以下，看清生物大分子是沒(méi)啥問(wèn)題了。電子的波長(zhǎng)是光子波長(zhǎng)的十萬(wàn)分之一左右，就像一根極細(xì)的探針，理論上它打在蛋白質(zhì)分子等生物大分子身上能被反射，這些反射的電子就能產(chǎn)生一張照片，這就是電鏡的基本原理。這也是電鏡能比光學(xué)顯微鏡分辨率高得多的原因。

起初，電鏡是在材料科學(xué)領(lǐng)域中使用的，主要是用其高分辨率來(lái)解析材料的結(jié)構(gòu)。電鏡在材料科學(xué)上的應(yīng)用遙遙領(lǐng)先于在生命科學(xué)上的應(yīng)用。直到1947～1961年，生物學(xué)家才借鑒材料科學(xué)中的重金屬染色技術(shù)，利用電鏡技術(shù)觀測(cè)到了許多細(xì)胞亞顯微結(jié)構(gòu)，如葉綠體、線粒體、核糖體，等等。然而，電鏡的局限性也很明顯，那就是不能看到活生生的生物大分子。因?yàn)殡婄R需要在高真空條件下工作，而生物樣品的含水量很高，水分的揮發(fā)使整個(gè)樣品無(wú)法保持真空。另外，電鏡的電子攜帶的能量很高，會(huì)把細(xì)胞“殘忍地?zé)馈?。這樣一來(lái)，生物學(xué)家就難以研究分子在活細(xì)胞中的正?；顒?dòng)。

速凍凝固生命細(xì)節(jié)

為了讓電鏡也能看到活細(xì)胞內(nèi)的生物分子，科學(xué)家想了很多辦法。最終想到的辦法就是速凍。這就好比科幻小說(shuō)中的冷凍休眠，把活人速凍之后，人體組織和細(xì)胞進(jìn)入幾乎沒(méi)有活動(dòng)的休眠狀態(tài)。多年以后，采用合理的方法解凍，人體又活過(guò)來(lái)了。也就是說(shuō)，速凍的細(xì)胞雖然幾乎不能活動(dòng)，但是它們的的確確具有生物活性。

在冷凍電鏡中，生物大分子被迅速冷凍，使得標(biāo)本內(nèi)部和周圍的水被固定為玻璃態(tài)，以防止晶體的形成。玻璃態(tài)——一種看上去是固體，但其分子排列是無(wú)序的形態(tài)，所以是不折不扣的流體。為什么是玻璃態(tài)而不是冰（晶體）呢？首先，是為了保護(hù)生物大分子，凍成冰有可能讓生物大分子發(fā)生脫水，冰晶也容易傷害生物。其次，冰會(huì)衍射電子，從而降低電鏡觀察的圖像質(zhì)量。

利用電鏡向冷凍樣本發(fā)射電子束，被玻璃態(tài)速凍水包裹的生物大分子處于“休眠狀態(tài)”，不再怕電鏡的真空環(huán)境，也不怕高能電子來(lái)“燒”它。散射后的電子通過(guò)一個(gè)鏡頭形成二維且放大的圖像，并記錄在檢測(cè)器上。結(jié)合從各個(gè)角度拍攝的圖像并取這些角度的平均值，可以生成生物大分子結(jié)構(gòu)的3D模型。

最早發(fā)明冷凍電鏡的是亨德森，當(dāng)時(shí)他用X射線晶體衍射技術(shù)研究膜蛋白遇到了困境，因?yàn)槿缟衔乃f(shuō)，膜蛋白不能結(jié)晶。他用液氮冷凍的方法來(lái)保護(hù)視紫紅質(zhì)蛋白（一種膜蛋白）樣品不被電子束摧毀。終于在1975年，第一個(gè)非常粗糙的視紫紅質(zhì)蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)表了出來(lái)，圖片上可以看出七個(gè)跨膜蛋白鏈。

不過(guò)，亨德森所發(fā)明的速凍技術(shù)比較粗糙，獲得的圖像也非常模糊。速凍，聽(tīng)起來(lái)好像是一件非常容易的事情，不就是快速冷卻么？然而，科學(xué)家探索了很久才找到合理的方法。1982年，杜波謝找到了一種快速冷凍的方法，使水分子還來(lái)不及變成排列整齊的冰晶就被凍成像玻璃一樣的物質(zhì)。

杜波謝發(fā)現(xiàn)，雖然水被冷凍之后極易形成冰晶，如六角形的晶體或者立方晶體，但當(dāng)水被十分迅速地冷凍時(shí)（冷凍速度約2.6x105℃/秒），就不會(huì)形成晶體，而成為無(wú)定形的冰（即“玻璃態(tài)”）。將溶液中的生物大分子速凍在玻璃態(tài)的水中，就可以在液氮溫度下使用電鏡進(jìn)行觀察。這奠定了冷凍電鏡制樣與觀察的基本技術(shù)手段，標(biāo)志著冷凍電鏡技術(shù)的誕生。

不過(guò)，杜波謝的冷凍電鏡獲得的圖像的細(xì)節(jié)還不是很豐富，那些生物分子在照片中都是難以名狀的一團(tuán)團(tuán)的物體，這一領(lǐng)域的研究者也被戲稱為“難以名狀學(xué)家”（blobologist）。況且，電鏡獲得的都是二維圖像，難以確定生物大分子的三維結(jié)構(gòu)。

1986年，弗蘭克找到了合適的解決辦法。弗蘭克采用的方法是“同向拼圖”。他對(duì)同一種生物大分子不停地拍照，拍上數(shù)萬(wàn)張甚至幾十萬(wàn)張。聽(tīng)起來(lái)似乎有些嚇人，但是對(duì)自動(dòng)化的電鏡來(lái)說(shuō)，并非難事。難點(diǎn)在于如何對(duì)這些照片進(jìn)行后期處理。弗蘭克開(kāi)發(fā)出一種識(shí)別和合成的軟件，可以將從數(shù)以萬(wàn)計(jì)的照片中找到那些朝向相似的生物大分子挑選出來(lái)，然后再合成一張清晰的圖像，再把不同方向的清晰圖像合成起來(lái)，就可以得到生物大分子的三維結(jié)構(gòu)了。

我們以常見(jiàn)的CT舉個(gè)例子。如果醫(yī)生想看到患者腦組織的三維圖像，就需要用x射線從不同的方向掃描腦部，然后通過(guò)這些投影反推得到腦部的三維圖像。這與冷凍電鏡技術(shù)的三維重構(gòu)原理十分相似：如果樣品不具有任何對(duì)稱性，那么就需要沿著物體的不同方向進(jìn)行投影，再通過(guò)反傅里葉變換得到物體的三維圖像。

弗蘭克發(fā)明的方法被學(xué)術(shù)界稱為“單粒子冷凍電鏡三維重建”技術(shù)。單粒子法就是對(duì)分離純化的顆粒狀分子進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。既可以對(duì)有20面對(duì)稱結(jié)構(gòu)的病毒或螺旋對(duì)稱結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，也可以對(duì)像核糖體等大的可溶性復(fù)合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，還可以對(duì)溶解狀態(tài)的膜蛋白進(jìn)行分析。

如今，超過(guò)90%的冷凍電鏡都應(yīng)用這項(xiàng)技術(shù)來(lái)分析生物大分子。弗蘭克的軟件降低了圖片分析的門檻，讓這項(xiàng)技術(shù)擁有了普遍的應(yīng)用價(jià)值。具有里程碑意義的成果是，2013年加州大學(xué)舊金山分校的程亦凡、大衛(wèi)·朱利葉斯等人首次得到膜蛋白TRPV1的近原子級(jí)別高分辨率三維結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)表在英國(guó)出版的《自然》雜志上。

冷凍電鏡的作用

理解生物大分子和大的復(fù)合物的反應(yīng)機(jī)制是當(dāng)今生物學(xué)領(lǐng)域里的一項(xiàng)重要目標(biāo)。而冷凍電鏡可以很好地完成這項(xiàng)任務(wù)。冷凍電鏡的優(yōu)勢(shì)在于能夠在盡可能接近其天然形態(tài)的水合狀態(tài)下觀察大分子。這種在原子分辨率下捕獲生物分子的圖像和結(jié)構(gòu)的能力，將極大地幫助研究人員理解關(guān)鍵的生物過(guò)程，并建立結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)聯(lián)。

長(zhǎng)期以來(lái)，由于對(duì)分子結(jié)構(gòu)的不了解，許多疾病沒(méi)辦法治療，而如今技術(shù)和發(fā)明日新月異，意味著我們?cè)趯?lái)可以針對(duì)很多的疾病，研發(fā)出非常有效的藥。冷凍電鏡技術(shù)的進(jìn)展聽(tīng)上去很簡(jiǎn)單：分辨率提高到0.35納米。然而，這意味著我們可以看見(jiàn)原子，看見(jiàn)化學(xué)變化的過(guò)程，看見(jiàn)原子如何排列成分子，看見(jiàn)病灶的組織結(jié)構(gòu)如何改變。未來(lái)，或許我們還將看見(jiàn)某種藥物可以阻止大腦衰老。

冷凍電鏡技術(shù)在幫助醫(yī)生了解細(xì)胞變化過(guò)程和發(fā)病機(jī)理上發(fā)揮了重要作用，并且有助于藥物開(kāi)發(fā)。例如，在寨卡病毒的研究中，病毒結(jié)構(gòu)解析就起了重要作用。2016年以來(lái)，寨卡疫情引起了全世界的關(guān)注。這種由伊蚊傳播的病毒與出生缺陷以及神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫疾病存在關(guān)聯(lián)。冷凍電鏡成功地觀測(cè)到寨卡病毒的結(jié)構(gòu)，這是傳統(tǒng)電子顯微鏡無(wú)法做到的，也是這項(xiàng)新技術(shù)實(shí)際應(yīng)用的一個(gè)很好的例子。

目前，冷凍電鏡分辨率已經(jīng)很高，可以獲得生物大分子的原子結(jié)構(gòu)。如今，科學(xué)家還在進(jìn)一步努力提高冷凍電鏡的分辨率，以便揭示更多蛋白的結(jié)構(gòu)和功能。從而更好地了解細(xì)胞變化過(guò)程、發(fā)病機(jī)理并開(kāi)發(fā)治療手段。（責(zé)任編輯 張虹）