劉長營 馬攀 耿 威 林瀟 李 鈞

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一種糖代謝異常及全身新陳代謝異常并具有遺傳傾向的慢性疾病。據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟(IDF)估計，2013年患有糖尿病的成年人有3.8億，到2035年，預計增加到5.9億[1]。目前，我國糖尿病患病率為9.7%，患者人數(shù)近1個億，并呈快速增長趨勢[2]，已成為糖尿病第一大國。糖尿病分為1型和2型，有90%的糖尿病患者為2型糖尿病。糖尿病患者常伴有骨代謝及鈣、磷代謝的障礙，引起繼發(fā)性骨量減少及骨質疏松等DM性骨病[3]。臨床上要求種植修復的2型DM患者也日益增多。但2型DM一直被認為是種植手術的相對禁忌癥。糖尿病病人的異常高血糖狀態(tài)所引起的一系列病理變化，導致骨結合差，是糖尿病病人種植義齒失敗的重要原因。但2型糖尿病影響骨結合的具體機制尚不清楚。

骨結合是一個動態(tài)的骨改建過程，成骨細胞在此過程中起著非常重要的作用。而成骨細胞多起源于多潛能的骨髓間充質干細胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)。BMSCs具有多向分化潛能和自我更新能力，是骨組織再生的重要種子細胞，成骨發(fā)生的關鍵是BMSCs向成骨細胞方向分化，這可能也是形成種植體骨結合的關鍵。種植體與骨組織間的結合是一種動態(tài)的骨改建與吸收的過程，種植體植入后早期，在手術區(qū)血凝塊形成后，會有類似輕度的炎癥反應出現(xiàn)，包括大量的吞噬細胞和從鄰近骨膜組織來的未分化的BMSCs的增殖與分化，從周圍骨膜新分化的成骨細胞能夠分泌產生編織樣的骨基質最早與氧化表面形成接觸。因此，在骨損傷修復的過程中，骨髓間充質干細胞在損傷部位募集起著至關重要的作用[4,5]。DM是如何通過內環(huán)境影響B(tài)MSCs的生物學特性和功能，從而影響骨結合，機制目前尚不清楚。本研究以糖尿病患者BMSCs為研究模型，在體外模擬正常糖濃度和高血糖狀態(tài)，觀察糖尿病患者BMSCs生物學特性，為進一步探討糖尿病影響種植體骨結合的分子機制提供實驗基礎。

1.材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本來源 人牙槽骨BMSCs取自在首都醫(yī)科大學附屬北京口腔醫(yī)院種植中心行種植手術的病人，所收集的種植窩制備過程中產生的骨碎屑均向患者說明，征得患者知情同意并簽署知情同意書。

正常人入組標準：全身狀況良好，無系統(tǒng)性疾病，無傳染性疾病，無吸煙、飲酒等不良嗜好。

2型糖尿病患者入組標準：糖尿病病史，確診為2型糖尿病，空腹血糖＞6.2mmol/L，長期服用降血糖藥物，否認骨質疏松癥，否認其他系統(tǒng)病史，無吸煙飲酒等不良嗜好。

以上兩組牙列缺損患者入組時均進行年齡匹配(見表 1，表 2)。

表1 正常人患者基本情況

表2 糖尿病患者基本情況

1.1.2 主要試劑 DMEM高糖培養(yǎng)基，含糖量為4.5g/L(Gibco，美國)，DMEM低糖培養(yǎng)基，含糖量為1.0g/L(Gibco，美國),胎牛血清，青-鏈霉素，磷酸鹽緩沖液，胰蛋白酶(Gibco，美國)；Annexin V/PI細胞凋亡試劑盒(購自南京建成生物工程研究所，中國)；Trizol Reagent(Life Technologies，美國)，無水乙醇(國藥化學試劑，中國)，氯仿(國藥化學試劑，中國)。

1.2 方法

1.2.1 人牙槽骨骨髓間充質干細胞獲取、分離與培養(yǎng)與表面標記物鑒定 于種植手術中收集各級擴孔鉆凹槽以及種植窩中的骨屑，在無菌操作下放入15ml離心管(5mlPBS+1%青-鏈霉素)內,1100r/min離心6min，棄上清液，加入5mlDMEM培養(yǎng)基(15%胎牛血清，2 mmoL/L谷氨酰胺，100U／ml青霉素，100ug／ml鏈霉素)，重懸后移入6cm細胞培養(yǎng)皿中，置于37℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)，每日觀察細胞生長情況。培養(yǎng)到第6天，對細胞進行全換液，PBS清洗，盡量去凈培養(yǎng)瓶內骨屑。接下來每2～3天對細胞更換培養(yǎng)基。待細胞長至接近80%～90%融合狀態(tài)時，用0.25%胰蛋白酶按1∶2消化、傳代。

流式細胞儀檢測BMSCs表面標記物：取第5代細胞，0.25%胰蛋白酶含(EDTA)消化離心。PBS清洗一次，將細胞再以5×106/ml細胞濃度重懸于PBS中。取流式管，各取100μl細胞懸液，分別加入鼠抗人單克隆抗體CD45-FITC，CD90-FITC，HLA-DR-FITC，CD34-PE，CD44-PE，CD73-PE，CD105-PE，以及同型對照抗體Mouse IgG1-FITC，MOUSE IgG1-PE各20μl，4℃避光下孵育30min。1000r/min離心5min，PBS洗一次。棄去上清液，加入100μl PBS混勻，4℃避光保存。4h內流式細胞儀上樣，檢測相關分子的表達情況。

在本研究中，應用的正常人BMSCs和糖尿病患者BMSCs為4～5代，在同一實驗中，應用的BMSCs為同一代數(shù)。正常人和糖尿病患者BMSCs消化、傳代后各分為兩組，分別加入高糖培養(yǎng)基和低糖培養(yǎng)基。共四組細胞：正常人高糖組、低糖組；糖尿病高糖組、低糖組。

1.2.2 CFSE摻入及流式細胞術檢測細胞增殖實驗 每組細胞消化后，以0.1%BSA重懸細胞，調整細胞濃度為1×106/ml；加入2μl 5 mM CFSE，使CFSE終濃度為10μM；37℃孵育10min，冰上孵育5min；1500rpm離心10min，去上清，以DMEM培養(yǎng)基洗3次后，放入6孔細胞培養(yǎng)板，37℃、5%CO2培養(yǎng)；3d后，消化細胞，1500rpm離心10min，500μl 0.1%BSA重懸；流式細胞儀檢測(488通道)，使用Modfit軟件分析增殖指數(shù)。

1.2.3 Annexin V/PI及流式細胞術檢測細胞凋亡實驗 每組細胞用胰蛋白酶消化后，用PBS重懸細胞，計數(shù)，調整細胞濃度；取1×106重懸的細胞，1000g離心5min，棄上清，加入350μl結合液輕輕重懸細胞；加入5μl Annexin V-FITC，輕輕混勻；再加入5μl碘化丙啶(PI)，輕輕混勻；室溫(20～25℃)避光孵育10min，可以用鋁箔進行避光；隨即進行流式細胞儀檢測。

1.2.4 劃痕實驗檢測細胞遷移能力 將細胞按5×105/ml接種于6孔板中，37℃、5%CO2孵箱中孵育細胞，待細胞達到80%融合時，用200ul槍頭垂直于孔板底劃痕，PBS洗細胞3次，去除劃下的細胞，加入無血清培養(yǎng)基。放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每孔隨機選取5個不同的區(qū)域，分別于0h，6h，24h取樣，倒置熒光顯微鏡下，應用CellSens軟件分析。找到標記處，保證每個時間點測量均為同一位置，測量細胞間距離，隨機測量3次取平均值，拍照。遷移距離為兩個時間點測量值的差值。

1.2.5 細胞黏附實驗 將純鈦鈦片修整為1*1cm大小，丙酮浸泡、脫脂，無水乙醇反復沖洗，再用去離子水沖洗，高溫高壓消毒備用；將培養(yǎng)至第4代的BMSCs，取24孔細胞培養(yǎng)板，將預先消毒好的鈦片鋪入24孔板底部，每孔加入2*104個細胞鋪板，每樣本設3復孔，共4組；分別于6h，12h后吸出培養(yǎng)液，收集，待行細胞計數(shù)，加入4℃預冷2.5%戊二醛固定液固定1～2h；10%PB沖洗3次，每次10min，4℃保存；1%鋨酸4℃下固定1h。系列梯度酒精脫水，干燥，噴金。掃描電鏡觀察。觀察時將鈦片中心置于SEM視野的中央，再向固定方向移動視野，觀察每組BMSCs在鈦片表面的黏附形態(tài)，拍照。

細胞黏附率的測定：分別收集每組吸出的細胞懸液，上CountStar細胞計數(shù)儀計數(shù)，測定細胞黏附率，每組設3個復孔，細胞黏附率=(20000-培養(yǎng)液中剩余的細胞數(shù))/20000*100%。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計學分析，兩組計量資料比較采用t檢驗，多組計量資料比較采用ANOVA分析,P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2.結果

2.1 細胞形態(tài)觀察與生長狀況及表面標記物鑒定 在BMSCs細胞原代培養(yǎng)中，正常人BMSCs在第5～6天時可見細胞從組織塊中爬出，而2型糖尿病患者BMSCs則在第7～9天時才有少量爬出。兩者的細胞形態(tài)無明顯差異，細胞形態(tài)梭形或者三角形，隨著細胞數(shù)量的增多和生長，胞棱較大，核仁呈橢圓形。隨著細胞擴增，細胞間交織成網。正常人在第14天，細胞增殖良好，貼壁良好，成克隆性生長，可見克隆集落形成，集落中心細胞密集，周圍細胞呈放射狀或漩渦狀排列，形態(tài)與成纖維樣細胞相似，成指紋樣生長，細胞融合達到80%，此時進行傳代。而2型糖尿病患者細胞經16～20d培養(yǎng)后，融合達到底面積80%時，才能進行傳代(見圖1)。

圖1 A：糖尿病患者原代BMSCs(40x)；B：傳代后(P5)糖尿病BMSCs(40x)；C：傳代后(P5)糖尿病BMSCs(100x)；D：正常人原代BMSCs(40x)；E：傳代后(P5)正常人BMSCs(40x)；F：傳代后(P5)正常人 BMSCs(100x)。

傳代后兩者的細胞形態(tài)稍有不同，正常人種植窩來源的牙槽骨BMSCs隨著細胞擴增，細胞間更為密集，均勻，交織成網，細胞核較大，較為明顯，細胞的生長速度較快，每2～3d可傳代一次；而糖尿病患者BMSCs的細胞棱角稍大，細胞間的密集度稍小，其生長速度較正常人BMSCs的生長速度慢，需4～5d后傳代一次。

細胞表面標記物鑒定：采用第5代細胞，取樣抗體標記后上流式細胞儀。流式細胞術分析顯示CD44、CD73、CD90和CD105陽性表達，而CD34、CD45和HLA-DR陰性表達。陽性標志物表達均大于95%，陰性標志物表達均小于2%。表達情況及陽性率符合BMSCs一般特點(見圖2)。

圖2 人牙槽骨BMSCs細胞表面標志物表達情況。流式細胞術分析顯示CD44、CD73、CD90和CD105陽性表達，而CD34、CD45和HLA-DR陰性表達。

2.2 CFSE摻入及流式細胞術檢測細胞增殖實驗 通過應用CFSE摻入法及流式細胞術進行細胞增殖實驗發(fā)現(xiàn)，糖尿病高糖組增殖指數(shù)為17.16±0.437；糖尿病低糖組增殖指數(shù)為25.107±2.478；正常人高糖組增殖指數(shù)為18.587±1.688；正常人低糖組增殖指數(shù)為27.227±1.426；方差分析顯示，四組之間差異有顯著統(tǒng)計學意義。低糖組明顯高于高糖組。說明BMSCs細胞在高糖環(huán)境下的增殖明顯減弱(見圖3)。

2.3 Annexin V/PI及流式細胞術檢測細胞凋亡實驗 細胞凋亡實驗發(fā)現(xiàn)，四組BMSCs中糖尿病高糖組的細胞凋亡率最高，約為12.1%，而其他三組的細胞凋亡率明顯較小，其中正常人低糖組細胞凋亡最少。糖尿病低糖組細胞凋亡為4.43%；正常人高糖組細胞凋亡為3.49%；正常人低糖組細胞凋亡為2.56%；差異有統(tǒng)計學意義(見圖4)。

圖3 細胞增殖實驗：CFSE摻入法及流式細胞術進行細胞增殖實驗，在正常人和糖尿病患者組中，低糖組明顯高于高糖組，P＜0.05。

圖4 細胞凋亡實驗：四組BMSCs中糖尿病高糖組的細胞凋亡率最高，約為12.8%，而其他三組的細胞凋亡率明顯較小，其中正常人低糖組細胞凋亡最少。

2.4 細胞黏附實驗 通過細胞黏附率的檢測發(fā)現(xiàn)，正常人低糖組BMSCs在6小時的黏附率為88.13%±4.5%，稍高于其他三組，差異無明顯統(tǒng)計學意義，正常人高糖組黏附率為75.54%±13.79%，糖尿病高糖組黏附率為85.07%±7.08%，糖尿病低糖組為82.53%±8.29%。而12小時的黏附率四組均可達到87%～91%，差異無統(tǒng)計學意義(見圖4)。通過掃描電鏡發(fā)現(xiàn)，鈦片表面可見到BMSCs附著，細胞形態(tài)呈梭狀，邊緣有偽足伸出，細胞多尚未完全展開，偽足伸展不充分，細胞核體積較大，各組之間形態(tài)未發(fā)現(xiàn)明顯差異(見圖5A，B)。

圖5 細胞黏附實驗：四組細胞在6h 時黏附率可達75%～88%，12h時粘附率可達87%～91%，差異無統(tǒng)計學意義，P＞0.05。掃描電鏡發(fā)現(xiàn)(3000x)各組之間形態(tài)未發(fā)現(xiàn)明顯差異。A：正常人牙槽骨BMSCs；B：糖尿病患者BMSCs。

2.5 細胞遷移實驗 通過劃痕法進行細胞遷移能力測定，發(fā)現(xiàn)6小時和24小時后正常人BMSCs在高糖和低糖環(huán)境下遷移距離均大于糖尿病患者BMSCs的遷移距離，正常人組劃痕兩側的BMSCs 24h后幾乎融合在一起，而糖尿病患者劃痕兩側細胞尚有一定的距離。24h時正常人低糖組的遷移距離最高，為426.33±72.767μm；正常人高糖組遷移距離次之，為397.33±110.17μm；而糖尿病高糖組和低糖組分別為201.33±92.45μm和224.67±49.21μm，P＜0.05。在 6h時觀察發(fā)現(xiàn)正常人BMSCs的遷移距離大于糖尿病BMSCs的遷移距離，正常人組與糖尿病組之間差異有統(tǒng)計學意義(見圖 6)。

圖6 細胞遷移實驗：A：在倒置顯微鏡下測量細胞間距離，遷移距離為兩個時間點測量值的差值。B：倒置顯微鏡下觀察(40x)，糖尿病組BMSCs 24h后細胞遷移情況。C：倒置顯微鏡下觀察(40x)，正常人組BMSCs 24h后細胞遷移情況。*表示該組細胞遷移距離與正常人組之間差異有統(tǒng)計學意義。

3.討論

由于直接從患者牙槽骨取材有一定的創(chuàng)傷及風險，所以目前關于糖尿病患者牙槽骨骨髓間充質干細胞的研究還比較少，國內外許多研究多是采用正常的骨髓間充質干細胞在體外模擬不同的高糖環(huán)境，觀察BMSCs生物學特性的改變。國外曾有學者報道可通過收集種植擴孔鉆上骨屑來培養(yǎng)人牙槽骨骨髓基質干細胞[6]。本研究采用同樣的方法從種植手術過程所收集的骨屑中，可以成功的分離培養(yǎng)出BMSCs，探討出一種不需拔牙或組織活檢等即能獲得口腔頜面部組織工程種子細胞的方法，能夠對口腔頜面部組織工程帶來新的機遇，同時很可能是一種創(chuàng)傷最小的口腔頜面部種子細胞獲取的方法。通過這種方法對糖尿病患者牙槽骨BMSCs進行研究將比在體外模擬不同濃度的高糖環(huán)境更直接，更有效，能夠更好的為糖尿病患者牙種植提供理論和實驗基礎。

同時，本研究除了直接從糖尿病患者的種植過程中獲取BMSCs外，還對獲取的BMSCs在體外應用不同的糖濃度進行刺激，模擬糖尿病患者體內高血糖的水平，研究其BMSCs的生物學特性。本研究選擇的低糖濃度為1g/L，約為5.56mmol/L，近似于正常情況下的血糖水平；選擇的高糖濃度為4.5g/L，約為25mmol/L，與許多文獻報道的糖濃度接近。有文獻報道[7]，糖濃度達到24mmol/L時對細胞的增殖、骨基質礦化、成骨分化影響較明顯，所以本研究選擇25mmol/L作為高糖組。本研究將正常人和糖尿病患者的BMSCs分別應用兩種糖濃度培養(yǎng)基進行培養(yǎng)：糖尿病高糖組用來模擬糖尿病患者血糖未控制；糖尿病低糖組用來模擬糖尿病患者血糖控制良好的情況；正常人低糖組用來模擬正常人血糖水平；正常人高糖組用來模擬之前學者關于糖尿病BMSCs的研究。以正常人低糖組作為對照，本研究發(fā)現(xiàn)糖尿病高糖組BMSCs的增殖能力和遷移能力明顯下降，而細胞凋亡明顯增高；而糖尿病低糖組BMSCs僅在遷移能力上表現(xiàn)比對照組差，細胞增殖和細胞凋亡與對照組無明顯區(qū)別；而正常人高糖組僅增殖能力較對照組下降，而凋亡和遷移能力未發(fā)現(xiàn)明顯下降。所以之前有的研究采用正常的BMSCs細胞在高糖環(huán)境下進行培養(yǎng)來模擬糖尿病BMSCs，并不能完全反映出糖尿病患者的真實情況。本研究的分組更全面、更客觀。

本研究通過觀察糖尿病患者以及正常人的BMSCs的增殖、凋亡情況，發(fā)現(xiàn)糖尿病患者BMSCs在高糖環(huán)境下細胞的增殖能力明顯低于正常人的BMSCs，同時也低于在低糖環(huán)境下的增殖能力，而DM高糖組BMSCs的細胞凋亡率明顯高于其他三組。這提示我們糖尿病患者高糖環(huán)境嚴重影響了BMSCs的增殖能力，反而容易引起B(yǎng)MSCs的過早凋亡。Sun等[8]通過對2型糖尿病患者牙槽骨成骨細胞體外培養(yǎng)，也發(fā)現(xiàn)2型糖尿病患者牙槽骨成骨細胞增殖較緩慢。Dliloglu-Gurhan[9]等發(fā)現(xiàn)糖濃度的增高可以引起骨髓基質干細胞的過早衰老，使得骨髓基質干細胞的凋亡顯著增加、增殖減少。Gopalakrishnan[10]等也證實，高糖環(huán)境下骨髓間充質干細胞的增殖，堿性磷酸酶活性、鈣結節(jié)形成數(shù)目等都顯著降低，認為高糖環(huán)境下成骨細胞分化能力減弱，這可能是糖尿病骨質疏松的原因之一。這與本研究的結果類似。

種植體骨結合是種植成功的關鍵，成骨細胞在種植材料表面的附著、黏附和伸展是細胞和材料作用的第一期，對于細胞后期的增殖和分化進而形成良好的骨結合界面至關重要。由于細胞黏附后才發(fā)生遷移、增殖、分化并分泌鈣基質，細胞在材料表面的黏附直接影響到后繼的生物學行為，是接觸成骨的關鍵因素[11]。關于糖尿病患者牙槽骨BMSCs的粘附、遷移能力的實驗尚未見報道。本實驗除了對各組BMSCs的增殖、凋亡、成骨分化潛能等進行了研究，還對細胞的粘附和遷移能力進行了研究。通過細胞黏附率的檢測發(fā)現(xiàn)，各組BMSCs在6小時的黏附率為75.54%～88.13%。而12小時的黏附率四組均可達到87%～91%，差異無統(tǒng)計學意義。姜煥煥等[12]使用成骨細胞發(fā)現(xiàn)親水性純鈦表面6小時和12小時的細胞黏附率接近90%，與本實驗結果接近。進一步通過掃描電鏡發(fā)現(xiàn)，鈦片表面可見到BMSCs附著，細胞形態(tài)呈梭狀，邊緣有偽足伸出，細胞多尚未完全展開，偽足伸展不充分，細胞核體積較大，各組之間形態(tài)未發(fā)現(xiàn)明顯差異。本實驗觀察時間點為6小時和12小時，這考慮到BMSCs在接種后2～3小時開始粘附、貼壁，隨著時間的增長比如24小時后，細胞的增殖可能會影響細胞黏附率的檢測。

目前關于BMSCs在體內或體外的遷移規(guī)律的研究，特別是在損傷組織和病理條件下遷移的特性的研究還比較少。關于細胞遷移能力的檢測主要有Transwell遷移小室和劃痕方法(wound healing)。Transwell法應用范圍較廣，不受實驗條件限制，但是價格比較昂貴，相反劃痕法只需無菌移液管即可，比較方便經濟[13]。細胞劃痕法是簡捷測定細胞遷移運動與修復能力的方法，類似體外傷口愈合模型，在體外培養(yǎng)皿培養(yǎng)的單層貼壁細胞上，用無菌移液管或其它硬物在細胞生長的中央區(qū)域劃線，去除中央部分的細胞，然后繼續(xù)培養(yǎng)細胞至實驗設定的時間，取出細胞培養(yǎng)板，觀察周邊細胞是否生長(修復)至中央劃痕區(qū)，以此判斷細胞的生長遷移能力。通過劃痕法進行細胞遷移能力測定，發(fā)現(xiàn)6小時和24小時后正常人BMSCs在高糖和低糖環(huán)境下遷移距離明顯大于糖尿病患者BMSCs的遷移距離，正常人組劃痕兩側的BMSCs 24小時后幾乎融合在一起，而糖尿病患者劃痕兩側細胞尚有一定的距離。這說明糖尿病患者牙槽骨BMSCs的遷移(修復)能力較差，這可能也是糖尿病患者種植骨結合稍差的原因。而且，我們課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，DM患者BMSCs成骨分化能力比正常人BMSCs成骨分化能力差，推測糖尿病患者BMSCs生物學特性較正常人減弱，從而影響骨改建[14]，但是引起這些生物學行為改變的分子機制尚不清楚，還需要我們進一步研究。