趙振宇 李 影 王 港 朱子鵬 顧 斌

脫落乳牙牙髓干細(xì)胞(stem cells from human exfoliated deciduous teeth，SHED)是早期外胚葉間充質(zhì)組織頭部的神經(jīng)嵴細(xì)胞遷移衍生出的牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞，屬于牙源性干細(xì)胞，具有良好的生物學(xué)性能，包括較高的增殖能力、自我更新能力、廣泛的多向分化能力、且具有一定的免疫調(diào)節(jié)能力[1,2]。與恒牙牙髓干細(xì)胞(dental pulp stemcells，DPSC)相比，SHED具有增殖快、良好而確定的多向分化潛能和取材方便等特性，已經(jīng)成為口腔組織工程學(xué)和再生醫(yī)學(xué)研究中理想的種子細(xì)胞[3]。乳牙與恒牙在來源和成牙特性上相近，然而，在結(jié)構(gòu)和組織學(xué)上有一定差異，在干細(xì)胞功能上同樣存在一定差異，但具體機(jī)制不清。p38-MAPK信號通路在轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞外信號通路中發(fā)揮重要作用，是MAPK家族控制炎癥反應(yīng)及成骨分化的重要分子，它可因炎癥刺激內(nèi)霉素和滲透壓而激活，從而調(diào)控干細(xì)胞的遷移、分化和凋亡[4,5]。本研究獲取了人SHED及DPSC，將二者的生物學(xué)行為進(jìn)行了系統(tǒng)比較，我們的研究發(fā)現(xiàn)SHED的增殖活性劑及成骨分化能力均優(yōu)于DPSC。隨后我們進(jìn)一步檢測在成骨誘導(dǎo)條件下p38 MAPK的活化情況，并特異性抑制p38 MAPK檢測其在干細(xì)胞成骨分化過程中的作用，明確p38 MAPK在人SHED及DPSC增殖與成骨分化中的作用機(jī)制，為二者作為種子細(xì)胞的應(yīng)用提供一定研究基礎(chǔ)。

1.材料方法

1.1 材料 胎牛血清，DMEM培養(yǎng)基；0.25%胰蛋白酶(Sigma，St Louis，MO，USA)；青鏈霉素(Gibco BRL)；鏈霉素(Gibco BRL)；SB-203580(Selleck，美國)；IL-1β、TNF-α Elisa 試劑盒(上海通蔚生)；ALP染色試劑盒(上海碧云天)實(shí)時(shí)定量PCR儀IQ5(美國)；RNA抽提試劑盒及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Fermentas(美國)；Taq DNA聚合酶、dNTPs和引物上海生物工程公司(中國)；Syber Green熒光定量PCR檢測試劑盒Takara(日本)。Western及IP裂解液，BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天公司)；p38，p-p38 抗體 (Cell signaling，美國)；OCN抗體ALP抗體(Abcam，美國)；β-Actin，羊抗兔IgG(北京中杉金橋)。

1.2 樣本收集 于解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心口腔門診收集6歲兒童正常乳恒牙替換期自然脫落乳牙樣本。樣本數(shù)量為8例，其中女童5例，男童3例，脫落乳牙無明顯齲壞，無牙髓病變及根尖周炎，牙根吸收達(dá)牙根1/2-2/3，且所有納入個(gè)體無系統(tǒng)疾病。DPSC取材于18～20歲青年因正畸治療拔除的前磨牙或因埋伏阻生而拔除的第三磨牙樣本，樣本數(shù)量為8例，其中男性4例，女性4例。所取得恒牙均無明顯齲壞，無牙髓病變及根尖周病變，且所有納入個(gè)體無系統(tǒng)疾病。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，在患者知情同意的前提下進(jìn)行。

1.3 SHED和DPSC的原代培養(yǎng)和分離 消毒即將拔除的乳、恒牙牙體周圍組織，拔牙，立即置4℃預(yù)冷的含雙抗DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)瓶內(nèi)進(jìn)行原代培養(yǎng)。在超凈臺中，用含青、鏈霉素的0.1mL/L PBS液反復(fù)沖洗離體牙，無菌條件下仔細(xì)取出乳牙及恒牙牙髓組織，0.1mL/L PBS反復(fù)漂洗，剪碎至約1mm×1mm×1mm大小的組織塊。用4%Ⅰ型膠原酶的培養(yǎng)液消化30min，過70μm細(xì)胞篩網(wǎng)，組織塊和上清分別采用組織塊法和酶消化法培養(yǎng)細(xì)胞。前者25mL培養(yǎng)瓶組織塊貼瓶，2～4h翻瓶；后者1000r/min離心5min，棄上清，加入含15%FBS的DMEM培養(yǎng)液接種于35 mm培養(yǎng)皿，每3d換液，細(xì)胞達(dá)到約80%匯合時(shí)，胰酶消化傳代。采用有限稀釋法克隆化培養(yǎng)分離人乳牙牙髓干細(xì)胞及恒牙牙髓干細(xì)胞[6,7]，逐步擴(kuò)增，以P3代用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

1.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測 將第三代DPSCs及SHED以1×105的密度接種到24孔板中，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后，棄原培養(yǎng)液，PBS沖洗3遍，每孔加入1mL含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，72h后收集各孔內(nèi)的培養(yǎng)液，離心后取上清液進(jìn)行ELISA檢測。建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照IL-6、TNF-α ELISA檢測試劑盒(上海通蔚生)說明每孔加入待測樣品100μl，洗板，隨后加入一抗工作液50μl，混勻，37℃恒溫孵育60min，洗板，加入酶標(biāo)抗體工作液100μl反應(yīng)板充分混勻后置于37℃60min，洗板后加入底物液100μl，置于37℃避光反應(yīng)10min，最后每孔加入50μl終止液混勻，在450nm處測吸光值。

1.5 成骨誘導(dǎo)試驗(yàn) 將第三代SHED與DPSC以5×104個(gè)/mL的密度接種于6孔板中，用10%FBS的DMEM培養(yǎng)至細(xì)胞70%匯合后換成骨誘導(dǎo)液(含 5mmol/L β-甘油磷酸鈉，50μg/mL維生素C，1×10-8mol/L地塞米松、10%FBS的DMEM培養(yǎng)液)連續(xù)培養(yǎng)，每隔3d換液一次，根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)內(nèi)容進(jìn)行觀察培養(yǎng)。

1.6 堿性磷酸酶染色 SHED和DPSC成骨誘導(dǎo)7d后，棄原培養(yǎng)液，按照堿性磷酸酶試劑盒說明書配制染液，將細(xì)胞用PBS洗3次，加4%多聚甲醛固定液，固定30min。PBS洗3次，加ALP染液37℃孵育60min。蒸餾水輕輕沖洗，洗去染液，照相。顯微鏡下觀察染色結(jié)果，藍(lán)色為陽性。

1.7 實(shí)時(shí)定量PCR檢測 將SHED和DPSC常規(guī)培養(yǎng)及成骨誘導(dǎo)液7d后用Trizol裂解并提取總RNA，測定RNA濃度，分別反轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄所得cDNA利用Syber Green熒光定量PCR檢測試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR檢測，反應(yīng)體系均為 20μl。引物序列：IL-1β forward：5'-CCGT GCCTACGAACATGTC-3'，reverse 5'-CACA CAGAAGCTCATCGGAG-3'；TNF-α forward：5'-AACTCGAGTGACAAGCCCGTAG-3'，reverse 5'-GTACCAGTTGGTTGTCTTTGA-3'；PCNA forward：5'-GGCCGAAGATAACGCGGA TAC-3'，reverse 5'-GGCATATACGTGCAAA TTCACCA-3'；CCND1 forward：5'-ATGTTC GTGGCCTCTAAGATGA-3'，reverse 5'-CAGG TTCCACTTGAGCTTGTTC-3'；Runx2forward：5'-CCCGTGGCCTTCAAGGT-3'，reverse5'-C GTTACCCGCCATGACAGTA-3'；OCNforward：5'-CCCAGGCGCTACCTGTATCAA-3'，reverse 5'-GGTCAGCCAACTCGTCACAGTC-3'；β-Actin forward：5'-TGGCACCCAGCACAATG AA-3'，reverse 5'-CTAAGTCATAGTCCGCCT AGAAGCA-3'。反應(yīng)條件：95℃變性20min，95℃30s，60℃1min，40個(gè)循環(huán)。IQ5型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀監(jiān)測記錄數(shù)據(jù)，結(jié)果根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線由軟件自動計(jì)算后得出。驗(yàn)證該方法的重復(fù)性和擴(kuò)增效率。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行三次重復(fù)。

1.8 Western blot檢測細(xì)胞中的蛋白表達(dá) 采用細(xì)胞裂解液試劑盒分別提取常規(guī)培養(yǎng)條件、成骨誘導(dǎo)7d、SB-203580抑制后各組SHED與DPSC的總蛋白，測定蛋白樣本濃度，制備蛋白樣品。配置10%的分離膠、6%的濃縮膠和1×SDS電泳液，依據(jù)蛋白定量結(jié)果進(jìn)行蛋白上樣，電壓為80V，電泳20min待溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠后調(diào)整電壓至120V，電泳60min。隨后將凝膠中的蛋白在轉(zhuǎn)移電泳槽(200mA，2h)中轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluorid，PVDF)膜。用TBST配制的含有5%脫脂奶粉的封閉緩沖液對PVDF膜封閉2h，PVDF膜封閉一抗 p38(1∶800)、p-p38(1∶800)、ALP(1∶1000)、OCN(1∶1000)、β-Actin 為內(nèi)參，4℃12h。復(fù)溫1h后洗膜3次，每次5min。按說明書加入相應(yīng)濃度的二抗，室溫條件下封閉2h。TBST洗脫二抗，每次10min，共計(jì)3次。漂洗膜后加入電化學(xué)發(fā)光底物發(fā)光顯色試劑盒顯色，蛋白凝膠成像系統(tǒng)照相觀察。

1.9 細(xì)胞周期檢測 將實(shí)驗(yàn)組及對照組SHED和DPSC細(xì)胞消化后PBS洗兩次，制備細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL，PBS重懸細(xì)胞，后加入預(yù)冷的70%乙醇1.5mL吹打混勻，4℃過夜，離心棄乙醇，0.01M PBS洗2遍，加入5mol/L的碘化丙錠1mL，4℃避光染色30min，流式細(xì)胞儀(BD FACS Callibur，BD，USA)測定DNA含量，根據(jù)細(xì)胞不同的DNA含量判定細(xì)胞周期。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)分析。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；P＜0.05差異有顯著性。進(jìn)行多組間比較時(shí)，P值進(jìn)行Bonferroni校正。

2.結(jié)果

2.1 SHED和DPSC IL-1β、TNF-α分泌量及基因表達(dá)水平檢測 采用Elisa方法檢測SHED及DPSC IL-1β、TNF-α分泌量。結(jié)果顯示SHED IL-1β含量為98.7pg/106細(xì)胞顯著高于DPSC組(62.5pg/106細(xì)胞)(P＜0.05，圖1A)。與之趨勢一致的是SHED TNF-α含量為70.4pg/106細(xì)胞顯著高于DPSC組(113.2pg/106細(xì)胞)(P＜0.05，圖1A)。實(shí)時(shí)定量PCR對IL-1β、TNF-α在兩組細(xì)胞中表達(dá)的檢測結(jié)果與Elisa結(jié)果一致，SHED IL-1β、TNF-α分泌量顯著高于 DPSC，其中SHED IL-1β表達(dá)量是DPSC的3.4倍、TNFα的表達(dá)水平是DPSCs的4.6倍(P＜0.05，圖1B)。

圖1 常規(guī)培養(yǎng)3d，SHED和DPSC細(xì)胞因子的分泌及mRNA檢測

2.2 SHED和DPSC增殖及成骨分化能力檢測第三代細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)72h后收集cDNA進(jìn)行干細(xì)胞增殖能力的檢測。結(jié)果顯示，SHED中PCNA及CCND-1的表達(dá)水平顯著高于DPSC(圖2A)，將SHED和DPSC成骨誘導(dǎo)7d后進(jìn)行ALP染色，結(jié)果可見藍(lán)紫色著色部位，深淺程度并不均一(圖2B)。采用實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)行了成骨關(guān)鍵基因。結(jié)果顯示：SHED和DPSC成骨誘導(dǎo)7d后Runx2表達(dá)水平較各自對照組均顯著增高，且成骨誘導(dǎo)后SHED Runx2表達(dá)水平顯著高于DPSC(P＜0.05)(圖2C)。另一成骨關(guān)鍵基因OCN的表達(dá)情況與Runx2趨勢一致，結(jié)果顯示成骨誘導(dǎo)7d后OCN在SHED中的表達(dá)水平顯著高于DPSC成骨誘導(dǎo)組(P＜0.05＝(圖 2D)。

2.3 p38在SHED和DPSC成骨分化過程中的表達(dá) 將SHED和DPSC成骨誘導(dǎo)7d后提取了各自對照組及成骨誘導(dǎo)組的全細(xì)胞蛋白，WesternBlot檢測p38及功能化的p-p38在細(xì)胞中的表達(dá)。結(jié)果顯示p38在SHED和DPSC常規(guī)培養(yǎng)及成骨誘導(dǎo)條件下均表達(dá)，成骨誘導(dǎo)后p38的含量略降低。而p-p38在DPSC對照組并不表達(dá)，成骨誘導(dǎo)后表達(dá)量增高。p-p38在SHED成骨誘導(dǎo)前后均表達(dá)成骨誘導(dǎo)7d后其表達(dá)量增高(圖3)。

圖2 SHED和DPSC增殖與成骨分化潛能檢測

圖3 SHED和DPSC成骨誘導(dǎo)7d后Western Blot檢測p-p38及p38蛋白檢測，以β-Actin作為內(nèi)參

2.4 抑制p38 MAPK對SHED和DPSC增殖及成骨分化能力的影響 加入10μmol/L特異性p38 MAPK抑制劑SB203580 60min[8]后收集SHED和DPSC全細(xì)胞蛋白Western Blot結(jié)果顯示SB203580可顯著抑制功能化的p-p38(圖4)。在SB203580抑制SHED和DPSC 60min后P更換為常規(guī)培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)4d后檢測細(xì)胞周期。結(jié)果顯示SHED對照組G1G0期細(xì)胞比例為34.57%，G2M期為7.23%，S期為58.2%；SHED SB203580干預(yù)組G1G0期細(xì)胞比例為75.7%，G2M期為0.08%，S期為24.22%；DPSC對照組G1G0期細(xì)胞比例為45.9%，G2M期為0.89%，S期為53.22%；DPSC SB203580干預(yù)組G1G0期細(xì)胞比例為85.24%，G2M期為2.0%，S期為12.76%(圖5A)。隨后采用Western Blot檢測在SB203580抑制SHED和DPSC60min后成骨誘導(dǎo)7d后，結(jié)果顯示抑制p38 MAPK可抑制SHED和DPSC OCN及ALP的表達(dá)(圖 5B)。

圖4 p38 MAPK抑制劑SB203580干擾60min后兩種細(xì)胞p38MAPK表達(dá)

圖5 A：SB203580干擾SHED和DPSC后流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期

3.討論

乳牙牙髓干細(xì)胞起源于神經(jīng)嵴，存在于牙髓血管周圍，在兒童及青少年脫落的乳牙中含有豐富的SHED，最近的研究表明：SHED具有多向分化潛能，可治療包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡缺血性腦損傷脊髓損傷和肌萎縮等動物模型的疾病，相比其他干細(xì)胞具有更強(qiáng)的自我更新性能，表現(xiàn)為克隆形成多、生長穩(wěn)定、增殖快速等特點(diǎn)[9-12]。除了組織再生潛能外，SHED還具有優(yōu)越的免疫調(diào)節(jié)性能。SHED的臨床應(yīng)用前景非常廣泛，但其具體的成骨作用機(jī)制仍不明確。鑒于此本研究選擇青年患者的DPSC作為對照細(xì)胞，將其生物學(xué)性能與SHED進(jìn)行相應(yīng)對比。

我們的研究結(jié)果顯示SHED的IL-1β、TNF-α分泌量及基因表達(dá)水平均顯著高于DPSC，這與Silva Fde S13的研究結(jié)果一致。IL-1β、TNF-α在SHED中有較高的分泌量及基因表達(dá)量這提示SHED與免疫調(diào)節(jié)密切相關(guān)，其免疫學(xué)性能及干細(xì)胞分化性能均優(yōu)于牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞。在干細(xì)胞功能方面本研究進(jìn)行了干細(xì)胞的增殖潛能及成骨分化潛能兩個(gè)方面的檢測。優(yōu)良的種子細(xì)胞需具備較好的干細(xì)胞自我更新能力，干細(xì)胞的增殖是自我更新的一個(gè)重要指標(biāo)。因此我們檢測了細(xì)胞增殖中的關(guān)鍵基因PCNA及CCND-1二者均是檢測細(xì)胞周期的重要指標(biāo)，我們的研究結(jié)果顯示SHED較DPSC有更優(yōu)異的細(xì)胞增殖能力。隨后我們采用ALP染色及實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測了其成骨分化能力。結(jié)果表明其成骨分化能力同樣優(yōu)于DPSC。這與前期的研究報(bào)道結(jié)果一致[3]，上述結(jié)果表明SHED具備優(yōu)異的干細(xì)胞性能。在干細(xì)胞的成骨分化過程中多種分子信號通路同時(shí)發(fā)揮調(diào)控作用，明確其成骨分化的機(jī)理更有益于SHED作為種子細(xì)胞的臨床應(yīng)用。

MAPK是一組可以被多種細(xì)胞外信號激活的蛋白絲氨酸-蘇氨酸激酶，處于胞漿信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的終末位置，主要參與生長因子、激素、細(xì)胞因子、應(yīng)激等多種刺激下的細(xì)胞反應(yīng)以及細(xì)胞的生長分化。目前，MAPK家族有五大類成員，分別為細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(Extracellular-signal regulated protein kinase，ERK)1/2、c-Jun氨基末端激酶(JNK)/應(yīng)激激活蛋白激酶(Stress-activated protein kinase，SAPK)、p38 MAPK、ERK5/BMK1(big MAP kinase 1)和ERK3/4等[14]。其信號傳導(dǎo)途徑在間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞的增殖分化中有著重要的作用。p38MAPK的特異性抑制劑SB203580屬于腑睫異咪咕哇化合物。SB203580并不阻斷上游激酶對p38MAPK的激活，而是作用于p38MAPK本身。SB203580是一種可透過細(xì)胞膜的p38MAPK特異性抑制劑，其通過與ATP競爭性結(jié)合p38MAPK激酶的核酸結(jié)合位點(diǎn)而抑制p38MAPK激酶對其底物的磷酸化[8]。我們的研究表明SHED中p38MAPK的表達(dá)水平顯著高于DPSC，這可能是由于SHED中分泌及表達(dá)的炎癥因子升高所致。前期有研究表明p38MAPK與干細(xì)胞的炎癥狀態(tài)密切相關(guān)，一定劑量的LPS或者INF-γ均可激活細(xì)胞內(nèi)的p38MAPK[15,16]。而另一方面p38MAPK又參與細(xì)胞的成骨分化這也是SHED成骨分化能力增強(qiáng)的一個(gè)關(guān)鍵原因。本研究驗(yàn)證了SB203580可高效的抑制p38MAPK。在p38MAPK信號被阻斷后，流式細(xì)胞儀檢測的細(xì)胞周期結(jié)果表明無論SHED還是DPSC其增殖指數(shù)都相應(yīng)下降，這提示干細(xì)胞的增殖能力受到一定的抑制。與此同時(shí)我們觀察到OCN及ALP的表達(dá)水平均下調(diào)。從干細(xì)胞增殖及成骨分化兩方面的結(jié)果來看p38MAPK可使間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)性能降低，尤其對SHED的成骨分化能力有很大影響。

SHED具有廣泛便捷的組織來源及優(yōu)秀的干細(xì)胞生物學(xué)性能，使其成為口腔頜面部骨組織再生中極具應(yīng)用前景的干細(xì)胞源。更值得關(guān)注的是：2015年7月，我國首家GMP級乳牙干細(xì)胞庫在世界口腔干細(xì)胞之父施松濤教授努力下落戶北京，這為SHED應(yīng)用提供了基礎(chǔ)并拓寬的應(yīng)用空間。本研究以SHED作為種子細(xì)胞研究MAPK信號通路在其成骨分化過程中的作用，為SHED的臨床應(yīng)用提供了一定的研究基礎(chǔ)。