鄭 城，王 濤，謝昌賢，云喜報，盧曉霞

1中國科學院成都生物研究所，成都 610041；2金河生物科技股份有限公司，呼和浩特 010200；3中國科學院大學，北京 100049

鹽霉素(salinomycin)是從白色鏈霉菌(Streptomyces albus)培養(yǎng)液中分離得到的天然聚醚類離子載體型抗生素[1]，其結構中含有獨特的三螺環(huán)縮酮結構，其中一個是不飽和六元環(huán)(圖2)。由于分子內氫鍵作用，鹽霉素可以以類似環(huán)狀結構的形式存在，通常認為這與其生物活性有關[2-4]。鹽霉素一直作為抗菌藥以及獸藥被廣泛使用，近年來研究發(fā)現(xiàn)鹽霉素還能夠選擇性地消除腫瘤干細胞和耐藥性腫瘤細胞[7]，并且其活性比臨床常用的抗癌藥物紫杉醇活性高100倍[8]。通過其結構中含氧官能團與堿金屬離子(K+，Na+)絡合形成具有親脂性外殼的堿金屬絡合物，從而在細胞和亞細胞膜間運輸金屬陽離子并破壞Na+/K+離子平衡而誘導細胞死亡[5,6]，鹽霉素有望成為一種潛在的新型抗癌藥物[9]。然而鹽霉素的抗癌活性還需要進一步提高，而且因其具有一定的毒性，影響了其成藥性。由于在鹽霉素的發(fā)酵生產過程中會產生一系列聚醚類鹽霉素類似物[10]，為了發(fā)現(xiàn)具有抗癌活性的新型鹽霉素類活性化合物，我們利用高效液相色譜柱后衍生方法檢測，采用制備色譜從鹽霉素發(fā)酵粗產物中分離出兩個鹽霉素類似物，通過紅外光譜、質譜和核磁共振譜等手段表征了這兩個新化合物，并對其抑制吲哚胺2,3-雙加氧酶(IDO)活性進行了初步研究。

1 儀器和材料

Agilent 1260高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)，色譜柱為安捷倫公司Zorbax Rx-C8 (4.6 × 150 mm,5 μm)；島津LC-8A制備液相色譜儀(日本島津公司)色譜柱為Daisogel SP-100-8-C8-HP (41.4 × 250 mm,8 μm)，Perkin Elmer Spectrum 100紅外光譜儀(美國珀金埃爾默公司)，Perkin Elmer model 341 旋光儀(美國珀金埃爾默公司)，Bruker Avance-600 MHz 核磁共振儀(瑞士布魯克公司)，Waters Xevo TQ質譜儀(美國沃特世公司)，Varioskan Flash 全波長掃描式多功能讀數(shù)儀(美國Thermo Scientific公司)。

鹽霉素發(fā)酵粗產物由金河生物科技股份有限公司(內蒙古)提供；分析級乙酸，硫酸，乙酸鈉三水合物，乙酸銨購自Fluka Chemie公司(瑞士)；HPLC級的乙腈和甲醇購自賽默飛公司(美國)。對二甲氨基苯甲醛、碳酸氫鈉、氘代氯仿購自阿拉丁公司；用于制備流動相的水通過Millipore Milli-Q plus純化系統(tǒng)純化并經過去離子化和蒸餾得到。Epacadostat購自畢得醫(yī)藥公司，犬尿氨酸酶(KYNU)檢測試劑盒購自武漢優(yōu)爾生公司，CCK-8試劑盒購自碧云天生物技術有限公司。

2 實驗部分

2.1 化合物的制備

2.1.1 檢測與制備色譜條件

檢測條件為：以80%溶劑A(乙腈)+20%溶劑B(100 mM乙酸銨緩沖溶液)為流動相，設置柱溫為30 ± 0.5 ℃，流動相流速為0.6 mL/min，衍生反應溫度為95 ± 0.5 ℃，衍生試劑流速為0.7 mL/min，檢測波長為585 nm。一次和二次制備條件一致：以80%溶劑A(乙腈)+ 20%溶劑B(100 mM乙酸銨緩沖溶液)為流動相，設置柱溫為30 ± 0.5 ℃，流動相流速為50.0 mL/min，檢測波長：210 nm；脫鹽色譜條件為：以90%溶劑A(乙腈)+ 10%溶劑B(水)為流動相，設置柱溫為30 ± 0.5 ℃，流動相流速為50.0 mL/min，檢測波長：210 nm。

2.1.2 樣品前處理和化合物制備

稱取7.7 g乙酸銨于1.0 L錐形瓶，用水定容，再用冰醋酸調節(jié)pH值4.75得100 mM乙酸銨緩沖溶液；稱取25.0 g對二甲氨基苯甲醛于1.0 L錐形瓶中，加入600 mL甲醇溶解，緩慢加入12 mL硫酸，攪拌得衍生試劑。稱取約100.0 g鹽霉素發(fā)酵粗產物，置于1.0 L燒杯中，加入650 mL中性甲醇，超聲15 min，然后用3 000 rpm離心機離心15 min，0.45 μm濾膜過濾，濾液做為樣品溶液。待基線平穩(wěn)后，吸取樣品溶液10 mL，注入制備色譜儀，記錄色譜圖，在制備色譜條件下對化合物A和B進行定位，然后根據(jù)分析結果計算出化合物A與化合物B在制備色譜圖上的相對保留時間分別為1.35和1.48。

吸取樣品溶液注入制備色譜儀，根據(jù)化合物A與化合物B的相對保留時間，進行分段收集。將收集液分別取樣、檢測，根據(jù)液相色譜檢測結果，將符合要求的化合物A(色譜純度大于80%)與化合物B(色譜純度大于60%)的制備液分別進行混合，得到化合物A的混合液約8.1 L，化合物B的混合液約4.2 L，濃縮，凍干得共收得一次制備化合物A約328 mg，化合物B約269 mg。將化合物A和化合物B的一次制備粉末分別加入50 mL中性甲醇溶解進行二次制備，在制備色譜儀上，進行分段收集。將收集液分別取樣、進行液相色譜儀檢測，根據(jù)檢測結果，將符合要求的化合物A與化合物B的收集液分別進行混合。得到化合物A的混合液約300 mL，化合物B的混合液約450 mL，濃縮得到化合物A的粗品溶液約40 mL，化合物B的粗品溶液約60 mL。

取鹽霉素粗品溶液10 mL，注入制備色譜儀，記錄在脫鹽色譜條件的色譜圖對化合物A和B進行定位。記錄化合物A與化合物B在脫鹽色譜圖上的出峰時間，分別吸取化合物A與化合物B的粗品溶液，注入制備色譜儀，根據(jù)定位試驗中化合物A與化合物B在制備色譜圖上的出峰時間進行分段收集，將收集液分別取樣，進行液相色譜儀檢測，根據(jù)液相色譜檢測結果，將含有化合物A與化合物B的收集液分別進行混合。得到化合物A的混合液約300 mL，化合物B的混合液約450 mL，濃縮，凍干，最后得到白色粉末化合物A約20 mg，色譜純度99.8%，白色粉末化合物B約17 mg，色譜純度98.3%。

2.2 哚胺2,3-雙加氧酶(IDO)抑制活性研究

將4-T1細胞接種于96孔板，密度1×105個/mL,培養(yǎng)24 h,加入INFγ(10 μg/mL)處理2 h，分別加入化合物A(10 μmol/L)、B(10 μmol/L)和Epacadostat(10 nmol/L)處理24 h,將犬尿氨酸酶抗體包被于96孔微孔板中， 加入50 μL細胞液上清，然后加入生物素化的犬尿氨酸酶抗體，洗板，加入HRP標記的親和素50 μL孵育20 min，洗板后加入TMB 45 μL孵育10 min，加終止液25 μL，立即酶標儀450 nm下測定吸光度。

將4T1細胞以104～105個細胞/孔的密度在96孔板中，細胞在CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h?；衔顰(10 μmol/L)、B(10 μmol/L)和Epacadostat(10 nmol/L)分別處理24 h后每個孔中加入10 μLCCK-8溶液，孵育2 h。酶標儀450 nm下測定吸光度。

3 實驗結果

3.1 鹽霉素類似物的制備

圖1 鹽霉素發(fā)酵產物的HPLC譜圖Fig.1 HPLC spectrum of salinomycin fermentation products

圖2 化合物A的HPLC譜圖Fig.2 HPLC spectrum of compound A

在鹽霉素發(fā)酵產品中，通過高效液相色譜(HPLC)柱后衍生化法檢測發(fā)現(xiàn)在鹽霉素主產物峰后還有兩個明顯的峰，其中兩個未知化合物A和B的含量分別達到4.13%和2.47 %(圖1)。因此利用高效液相色譜(HPLC)柱后衍生化法對A和B進行定位，采用制備色譜，經過一次制備，二次制備和脫鹽等過程制備分離得到純度分別為99.8%和結合質譜和核磁共振碳譜可確定化合物A的分子式為C43H72O11，分子量為765，比鹽霉素的分子量(751)高14個質量單位。化合物A的1H和13C NMR譜數(shù)據(jù)與鹽霉素文獻值[11,12]基本一致，表明它們具有相同的骨架，其區(qū)別在于鹽霉素中C-40位甲基信號δH0.96 ppm和δC11.3 ppm在化合物A中消失，而出現(xiàn)一組新的乙基信號δH1.25～1.42,1.43～1.54 ppm 和δC16.0 ppm與 δH0.87～0.90 ppm 和δC11.8 ppm，同時，C-5和C-6的化學位移值也發(fā)生了變化分別從δC27.0 和 29.0 ppm變?yōu)?δC21.9和34.9 ppm，可將δH1.25～1.42,1.43～1.54 ppm和δC16.0 ppm 與 δH0.87～0.90 ppm和δC11.8 ppm歸屬為40-CH2和40a-CH3，因此化合物A為40-甲基鹽霉素(圖4)。

98.3%(圖2和3)的兩個新化合物A和B。

3.2 化合物A和B的表征

結合質譜和核磁共振碳譜確定化合物B的分子式為C43H72O11，分子量為765，比鹽霉素的分子量(751)高14個質量單位?；衔顱的1H和13C譜數(shù)據(jù)與鹽霉素的文獻值[11,12]基本一致，表明它們具有相同的骨架，其區(qū)別在于鹽霉素中C-35位甲基信號δH0.93 ppm和δC17.9 ppm在化合物B中消失，而出現(xiàn)一組新的乙基信號δH0.91～0.95 ppm和δC11.0 ppm與 δH1.09～1.14,1.46～1.50 ppm和δC24.1 ppm，同時，C-14，C-13和C-15的化學位移值也發(fā)生了變化分別從δC33.6,77.4 和39.2 ppm變?yōu)?δC38.2,74.7和 34.6 ppm，可將δH0.91～0.95 ppm和δC11.0 ppm與 δH1.09～1.14,1.46～1.50 ppm和δC24.1 ppm歸屬為35a-CH3和35-CH2，因此化合物B為35-甲基鹽霉素(圖4)。

3.2 IDO抑制活性

吲哚胺2,3-雙加氧酶(IDO)是介導色氨酸沿犬尿氨酸途徑分解代謝的限速酶，其與腫瘤免疫抑制有關[13]，對化合物A和化合物B的吲哚胺2,3-雙加氧酶(IDO)抑制活性進行了研究，結果顯示(圖5)，化合物B能夠有效抑制犬尿氨酸的產生，且沒有細胞毒性，表明其具備一定的吲哚胺2,3-雙加氧酶(IDO)抑制活性。

圖5 化合物A和B的IDO抑制活性Fig.5 The IDO inhibitory activities of compounds A and B注：與空白對照組比較，* P < 0.05；** P < 0.01。Note:Compare with control,* P < 0.05;** P < 0.01.

4 結論

本論文利用制備色譜經過兩次制備和脫鹽，首次在鹽霉素發(fā)酵產物分離得到化合物A和B，通過紅外光譜、質譜和核磁共振譜等表征了這兩個新化合物。結構分析發(fā)現(xiàn)兩個新化合物均為鹽霉素類似物：化合物A為40-甲基鹽霉素，化合物B為35-甲基鹽霉素。生物活性研究表明，化合物B具有抑制吲哚胺2,3-雙加氧酶(IDO)活性，可作為一種潛在的抗腫瘤藥物，值得進一步研究。