鐘 維,唐天才,劉城成,陳天祥,馮忠勇,郝力力

(1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)系,四川 成都 610041;2.四川省若爾蓋縣動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心,四川 若爾蓋 624500)

細(xì)粒棘球蚴病俗稱包蟲病,是由細(xì)粒棘球絳蟲的中絳期幼蟲-細(xì)粒棘球蚴寄生在人和動(dòng)物體內(nèi)所致的一種嚴(yán)重的人獸共患寄生蟲病。若爾蓋縣是全國5大牧區(qū)之一,牦牛和藏綿羊是該地區(qū)主要的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物,也是細(xì)粒棘球絳蟲主要的中間宿主之一,數(shù)量分別達(dá)100萬和150萬余頭。當(dāng)?shù)厝罕娦l(wèi)生知識(shí)匱乏,畜牧業(yè)生產(chǎn)管理粗放,為包蟲病的發(fā)生和流行提供了極為有利的條件。近年來,對若爾蓋縣牦牛、藏綿羊細(xì)粒棘球蚴病的調(diào)查鮮有報(bào)道,到目前為止,尚不清楚該地區(qū)細(xì)粒棘球絳蟲的流行情況,本試驗(yàn)用COI基因特異性引物對若爾蓋縣牦牛、藏綿羊細(xì)粒棘球蚴感染情況展開了調(diào)查,以確定若爾蓋縣細(xì)粒棘球絳蟲的蟲種。

1 材料與方法

1.1 主要儀器設(shè)備和試劑 臺(tái)式高速離心機(jī)(Eppendorf 5402型)、Bio-Rad伯樂梯度 PCR儀(PTC240型)、2×Easy Taq PCR SuperMix(北京全式金生物技術(shù)有限公司);組織基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司);細(xì)粒棘球絳蟲G1株基因組DNA由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 包囊樣本的采集 由若爾蓋縣動(dòng)物疫控中心負(fù)責(zé)采集,共采集牦牛和藏綿羊肝、肺組織包囊58份,均來自若爾蓋縣屠宰場。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取 使用天根生化科技(北京)有限公司組織基因組DNA提取試劑盒,按照說明書進(jìn)行操作。

1.3.2 COI基因PCR檢測 包囊樣本采用PCR方法進(jìn)行檢測,反應(yīng)體系、條件和引物參照Bowles所采用的方法[1],COI基因特異性引物序列為：F1：5′-TTTTTTGGGCATCCTGAGGTTTAT-3′,R1： 5′-TAAAGAAAGAACATAATGAAAATG-3′,陽性產(chǎn)物送華大基因科技服務(wù)有限公司測序。

1.3.3 進(jìn)化樹分析 核苷酸序列應(yīng)用Clustal X 1.81進(jìn)行比對,分子進(jìn)化樹用MEGA6構(gòu)建。

2 結(jié)果

2.1 牦牛和藏綿羊臟器上的包囊 對58個(gè)疑似感染細(xì)粒棘球蚴的牦牛、藏綿羊包囊(其中牦牛肝包囊12個(gè),肺包囊26個(gè),藏綿羊肝包囊20個(gè))進(jìn)行調(diào)查分析,由中插彩版圖1所示,牦牛包囊均為單個(gè)存在,相互之間無通連現(xiàn)象。剖開有大量清澈的包囊液,尤其是肝臟包囊,內(nèi)有大量子囊。通過鏡檢,所有牦牛臟器上的包囊內(nèi)均無原頭節(jié),均為不育囊,且牦牛包囊多見于肺臟,肝包囊較少。藏綿羊臟器上的包囊多見于肝臟,包囊數(shù)目較多,剖開后囊液清澈,內(nèi)有大量原頭節(jié),如中插彩版圖2所示。

2.2 PCR檢測

包囊COI基因檢測結(jié)果：采用Bowles建立的PCR方法進(jìn)行檢測,58頭包囊樣本共檢出32頭陽性,如圖3所示,在400～500 bp間出現(xiàn)目的條帶,目的條帶為440 bp,總感染率為55.1%。

圖3 部分陽性樣本COI基因PCR反應(yīng)后電泳圖

2.3 進(jìn)化樹分析 將32個(gè)包囊陽性樣本測序后,最終得到6個(gè)克隆,6個(gè)序列和 G1株(AB491440)的同源性在99.3% ～100%之間,將6個(gè)分離株的測定序列和GenBank參考序列進(jìn)行種系發(fā)育關(guān)系分析,應(yīng)用Mega6軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹,如圖4所示,分離到的6個(gè)COI基因序列全部屬于G1株,它們位于一個(gè)大的分支上：其中6和G1親緣關(guān)系最近,其次是16和4,8、32、31處于同一分支上,親緣關(guān)系最近,但8和32親緣關(guān)系更近。

圖4 6個(gè)分離株在基于COI基因構(gòu)建的細(xì)粒棘球絳蟲進(jìn)化樹上的分布

3 討論

若爾蓋縣只有一個(gè)屠宰場,屠宰場屠宰不規(guī)范,容易出現(xiàn)臟器隨意丟棄的現(xiàn)象,極易使吞食含有包囊臟器的犬感染包蟲病。本試驗(yàn)僅對若爾蓋縣屠宰場的58個(gè)疑似感染細(xì)粒棘球蚴的牦牛、藏綿羊的肝、肺組織包囊進(jìn)行PCR了檢測,所有包囊陽性率為55.1%(32/58),其中有26個(gè)疑似包囊未檢出,可能是由肝片吸蟲、結(jié)核桿菌等病原造成的。由于屠宰場沒有對包囊來源的牛、羊屠宰基數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì),且早期感染包囊不明顯,存在一定的漏檢,故屠宰后包囊的疑似感染率是一個(gè)未知數(shù),后期還需屠宰場對包囊來源的牛、羊基數(shù)進(jìn)行系統(tǒng)登記以確定包囊的準(zhǔn)確檢出率。

狐貍、犬、狼等終末宿主吞食中間宿主牦牛、藏綿羊包囊而感染包蟲,成蟲在小腸內(nèi)發(fā)育成熟排出蟲卵,污染草、飼料和飲水,牛羊等中間宿主因吞食蟲卵而受感染。本研究對若爾蓋縣58個(gè)疑似感染細(xì)粒棘球蚴的牦牛、藏綿羊包囊(其中牦牛肝包囊12個(gè),肺包囊26個(gè),藏綿羊肝包囊20個(gè))進(jìn)行調(diào)查分析得到所有藏綿羊包囊內(nèi)均有原頭節(jié),如果包囊未能被正確銷毀,犬吞食后在犬體內(nèi)發(fā)育成成蟲,排出蟲卵污染環(huán)境;有文獻(xiàn)報(bào)道,大部分牛包囊為不育囊,只有少數(shù)包囊內(nèi)有原頭節(jié)[2],本試驗(yàn)中所有牦牛包囊內(nèi)雖無原頭節(jié),但該縣牦?；鶖?shù)大,犬通過采食含有細(xì)粒棘球蚴的牦牛臟器也極易受到感染。

線粒體DNA中的COI基因可以作為生物條形碼對物種進(jìn)行鑒定[3]。據(jù)報(bào)道,細(xì)粒棘球絳蟲有10個(gè)不同的種(G1～G10),其中G1株在世界范圍內(nèi)流行最為廣泛,也是我國的主要流行株[4]。本研究以細(xì)粒棘球絳蟲COI基因?yàn)榘谢?對若爾蓋縣58個(gè)疑似感染細(xì)粒棘球蚴的牦牛、藏綿羊的肝、肺組織包囊進(jìn)行了PCR檢測,最終通過進(jìn)化分析確定該縣動(dòng)物所感染包蟲的蟲種為細(xì)粒棘球絳蟲G1株,為該地區(qū)后期包蟲病的防控、畜牧業(yè)健康發(fā)展提供了數(shù)據(jù)支持。