賈忠娟， 王 琳， 田怡然， 海博寧， 邵吉民

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)與病理生理學(xué)系， 浙江大學(xué)附屬第二醫(yī)院腫瘤研究所， 浙江 杭州 310058)

近年來癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)和國(guó)際癌癥基因組聯(lián)盟(International Cancer Genome Consortium，ICGC)等大規(guī)模腫瘤基因組計(jì)劃的實(shí)施，以及伴隨的基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組和生物信息學(xué)等組學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，極大推動(dòng)了腫瘤突變譜鑒定及其產(chǎn)生的腫瘤新抗原(neoantigen)的研究。 本文就腫瘤新抗原的鑒定以及基于腫瘤新抗原的免疫治療技術(shù)包括腫瘤治療性疫苗和細(xì)胞治療等技術(shù)的研發(fā)作一綜述。

腫瘤特異性抗原是體細(xì)胞基因由于理化損傷因素誘發(fā)或自發(fā)突變而產(chǎn)生的具有免疫原性的新生抗原，即腫瘤新抗原[1]。腫瘤新抗原只存在于腫瘤細(xì)胞而不存在于正常細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞基因突變產(chǎn)生的表位肽與主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)I類分子結(jié)合而被遞呈到細(xì)胞表面，可被經(jīng)獲得性免疫應(yīng)答程序激活的相應(yīng)特異性T細(xì)胞識(shí)別而殺傷腫瘤細(xì)胞。

迄今的研究揭示，腫瘤細(xì)胞基因組突變具有不同個(gè)體、不同腫瘤類型、以及同一個(gè)體同一腫瘤的不同腫瘤細(xì)胞克隆之間的異質(zhì)性，并具有可隨腫瘤進(jìn)展演化的特性，因而相應(yīng)地由突變產(chǎn)生的腫瘤新抗原也具有高度異質(zhì)性。已有研究報(bào)道的MHC I類分子限制性腫瘤新抗原的腫瘤類型包括黑色素瘤、乳腺癌、腎細(xì)胞癌、胃腸道癌、肺癌、膠質(zhì)細(xì)胞瘤以及頭頸部惡性腫瘤；已有研究報(bào)道的MHC II類分子限制性腫瘤新抗原的腫瘤類型還包括黑色素瘤、白血病、膽管細(xì)胞癌和食管癌等[2-10]。

目前，腫瘤新抗原的篩選和免疫原性鑒定的基本流程包括分別應(yīng)用基因組和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序鑒定腫瘤樣本中的突變及其轉(zhuǎn)錄水平，再應(yīng)用計(jì)算機(jī)軟件輔助預(yù)測(cè)腫瘤突變肽與MHC I和II類分子的親和力，和/或應(yīng)用質(zhì)譜鑒定與MHC分子結(jié)合的表位肽，在確定候選腫瘤新抗原表位后進(jìn)行多肽合成，然后通過各種體外和體內(nèi)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)鑒定候選腫瘤新抗原的免疫原性，最后應(yīng)用于基于腫瘤新抗原的治療性疫苗或T細(xì)胞治療等臨床試驗(yàn)研究[2-3, 11-13]，見圖1。

Figure 1. Workflow diagram for identification of tumor neoantigens.

圖1 腫瘤新抗原篩選和免疫原性鑒定流程圖

1 基于基因組和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的腫瘤新抗原篩選和預(yù)測(cè)

隨著二代測(cè)序(next-generation sequencing，NGS)技術(shù)的發(fā)展，運(yùn)用個(gè)體腫瘤的基因組測(cè)序(包括全基因組測(cè)序和外顯子組測(cè)序)數(shù)據(jù)可以相對(duì)容易地鑒定DNA序列突變。但在采集腫瘤組織測(cè)序樣本時(shí)應(yīng)注意腫瘤異質(zhì)性可導(dǎo)致取自同一腫瘤不同部位的腫瘤細(xì)胞存在不同的突變譜，同時(shí)在設(shè)計(jì)基于腫瘤新抗原的治療技術(shù)如治療性疫苗時(shí)需要包含多種腫瘤新抗原的組合。此外，采集腫瘤和正常組織測(cè)序樣本時(shí)，腫瘤組織樣本中可能夾雜有部分正常細(xì)胞或間質(zhì)細(xì)胞，正常組織樣本也可能含有部分腫瘤細(xì)胞或突變細(xì)胞[14]。為了保證突變的檢出率，越來越多的研究選擇外周血作為正常樣本，而在無法獲得外周血時(shí)以癌旁組織作為正常對(duì)照[15]。

對(duì)基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)的突變需要分析核苷酸變化對(duì)編碼蛋白質(zhì)序列的影響。常用的自動(dòng)注釋軟件有Variant Effect Predictor (VEP)[16]和 ANNOVAR[17]。相對(duì)于單核苷酸變異(single-nucleotide polymorphism，SNV)，由插入或缺失(insertion-deletion，InDel)導(dǎo)致的移碼突變(frameshift mutation)和融合基因較難準(zhǔn)確注釋。而與點(diǎn)突變相比，由插入或缺失形成的新開放閱讀框(neo-open reading frames，neoORFs)所表達(dá)的新表位具有較強(qiáng)的免疫原性，更容易被T細(xì)胞識(shí)別進(jìn)而誘導(dǎo)高度特異性的抗腫瘤免疫，應(yīng)優(yōu)先考慮選擇此類腫瘤新抗原[18-19]。有研究表明，在具有高突變負(fù)荷的腫瘤中，50%的DNA突變不會(huì)轉(zhuǎn)錄成RNA，進(jìn)而也不表達(dá)為蛋白質(zhì)。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)能夠幫助篩選可以表達(dá)的癌細(xì)胞突變基因及其相對(duì)于野生型等位基因的表達(dá)水平，從而提高新抗原預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率[15]。近年有學(xué)者使用IntegrateNEO分析轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)融合肽新抗原[20]。此外，人類基因組中許多基因有多個(gè)轉(zhuǎn)錄本，通常選擇表達(dá)水平最高的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行注釋[21]。

通過腫瘤組織或外周血細(xì)胞樣本的外顯子組測(cè)序數(shù)據(jù)，可確定每個(gè)患者的單倍型人類白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)基因型(即人MHC基因型)。鑒定HLA分型方法包括HLAminer[22]、OptiType[23]以及ATHLATES[24]。HLAminer和OptiType也可以從轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)鑒定HLA單倍型。在高突變負(fù)荷腫瘤中，由于腫瘤細(xì)胞的HLA基因可能存在一個(gè)或多個(gè)突變，建議使用來自腫瘤組織樣本的HLA基因序列數(shù)據(jù)進(jìn)行評(píng)估和注釋，以確保新抗原預(yù)測(cè)中使用的是腫瘤細(xì)胞表達(dá)的HLA分子[21]。

基因組和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)過濾處理后，可通過NetChop、 NetMHCpan、NetMHC及SYFPEITHI等軟件分析剪切長(zhǎng)度以及與MHC I 和II類分子的親和力，從而預(yù)測(cè)潛在的新抗原表位[14, 25]。研究表明，MHC I類新抗原預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性高于MHC II類新抗原[26]。MHC II類新抗原較難預(yù)測(cè)，一方面由于對(duì)MHC II基因型了解較HMC I類基因少；另一方面MHC II類分子的突變肽結(jié)合槽結(jié)構(gòu)的兩端是開放的、可以結(jié)合更長(zhǎng)的肽，突變肽除了9個(gè)氨基酸殘基核心基序之外的兩側(cè)翼序列也可影響其與MHC II類分子的結(jié)合，使得突變肽的定位有較大的靈活性[15, 21]。最近有研究提出了一個(gè)新抗原質(zhì)量預(yù)測(cè)模型，提示與病原體衍生肽序列具有同源性的，同時(shí)與HLA分子比野生型肽有更強(qiáng)親和力的突變肽具有與臨床相關(guān)的更強(qiáng)的免疫原性。運(yùn)用新抗原質(zhì)量模型還能夠通過分析胰腺癌、肺癌和黑色素瘤等患者腫瘤突變數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)患者生存期的長(zhǎng)短[27-29]。

2 基于蛋白質(zhì)組技術(shù)的腫瘤新抗原的篩選和預(yù)測(cè)

2014年Yadav等[30]在小鼠腫瘤模型中首次應(yīng)用質(zhì)譜技術(shù)并結(jié)合外顯子組測(cè)序鑒定具有潛在免疫原性的腫瘤突變肽。2016年Bassani-Sternberg等[12]運(yùn)用質(zhì)譜技術(shù)直接鑒定了患者黑色素瘤樣本中的免疫多肽，包括癌-睪丸抗原和磷酸肽，并且在患者腫瘤和外周血中檢測(cè)到針對(duì)相應(yīng)新抗原的特異性T細(xì)胞。但直接從腫瘤組織鑒定HLA分子結(jié)合的突變肽的技術(shù)還存在如低豐度抗原肽難以鑒定等問題，因此往往還需要與外顯子組和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)聯(lián)合預(yù)測(cè)潛在的抗原肽。2018年Bulik-Sullivan等[31]通過基于質(zhì)譜數(shù)據(jù)的訓(xùn)練模型EDGE提高了HLA表位預(yù)測(cè)算法的特異性。利用生成的最大的腫瘤HLA多肽數(shù)據(jù)集和迄今為止報(bào)道的HLA分型數(shù)據(jù)來訓(xùn)練HLA多肽遞呈的深度學(xué)習(xí)模型，研究者表明通過優(yōu)化預(yù)測(cè)的多肽可以可靠地鑒定新抗原特異性T細(xì)胞，該方法僅需要有限體積的患者外周血，每位患者只需篩選少量肽，并且不依賴于MHC多聚體。

2018年Shao等[32]的論文介紹了SysteMHC Atlas(https://systemhcatlas.org)，這是一個(gè)旨在收集、組織、共享、可視化和探索基于質(zhì)譜技術(shù)產(chǎn)生的免疫肽數(shù)據(jù)的公共數(shù)據(jù)庫(kù)，以期通過統(tǒng)一公開使用的計(jì)算機(jī)算法或軟件來控制肽鑒定和注釋的質(zhì)量。項(xiàng)目還開發(fā)工具來檢索翻譯后修飾的MHC相關(guān)肽的信息，特別是磷酸肽、精氨酸甲基化肽及蛋白酶體產(chǎn)生的剪接肽?？梢灶A(yù)計(jì)該項(xiàng)目將會(huì)大大促進(jìn)針對(duì)各種免疫相關(guān)疾病(如自身免疫、過敏、傳染病和腫瘤)的疫苗和免疫療法的開發(fā)[32]。

3 腫瘤新抗原表位的選擇及免疫原性的鑒定

腫瘤新抗原的免疫原性的決定因素在除基因突變位點(diǎn)、取代氨基酸殘基性質(zhì)、以及轉(zhuǎn)錄水平之外，還受到較難預(yù)測(cè)的突變肽加工、轉(zhuǎn)運(yùn)、HLA分子結(jié)合遞呈、以及宿主免疫響應(yīng)等眾多因素的影響[29]。目前組學(xué)技術(shù)可發(fā)現(xiàn)眾多的腫瘤突變，尤其在具有高突變負(fù)荷的腫瘤中可發(fā)現(xiàn)數(shù)百甚至數(shù)千種突變。然而，預(yù)測(cè)的大多數(shù)腫瘤突變肽在體內(nèi)或體外不能誘導(dǎo)T細(xì)胞應(yīng)答。據(jù)報(bào)道腫瘤新抗原預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率僅10%～30%[33]。因此組學(xué)測(cè)序和生物信息學(xué)算法預(yù)測(cè)的腫瘤突變表位還需要通過體外和/或體內(nèi)試驗(yàn)驗(yàn)證其免疫原性，如應(yīng)用突變肽直接負(fù)載或用突變基因的串聯(lián)小基因(tandem mini-genes，TMG)轉(zhuǎn)染抗原遞呈細(xì)胞，然后應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)、酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)(enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT)、胞內(nèi)因子染色實(shí)驗(yàn)(intracellular cytokine staining，ICS)、突變肽-HLA分子四聚體(pHLAmultimer)、靶細(xì)胞殺傷、或動(dòng)物模型體內(nèi)實(shí)驗(yàn)等方法檢測(cè)前者能否誘導(dǎo)T細(xì)胞活化和殺傷腫瘤靶細(xì)胞。用于實(shí)驗(yàn)的免疫細(xì)胞來自患者腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(tumor-infiltrating lymphocyte，TIL)以及患者或健康供體的外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)。這些方法可以鑒定腫瘤患者中存在的記憶T細(xì)胞以及或患者或健康供體中的反應(yīng)性幼稚T細(xì)胞的免疫應(yīng)答[2-3, 11-13, 25, 28]。

典型的例子，如2016年Stronen等[34]發(fā)現(xiàn)從健康供體外周血分離的T細(xì)胞對(duì)3例黑色素瘤患者預(yù)測(cè)的新抗原產(chǎn)生免疫反應(yīng)，甚至包括患者自身T細(xì)胞忽略的新抗原。再如2017年Zhang等[4]對(duì)三例乳腺癌患者的PDX(patient-derived xenografts)樣本進(jìn)行外顯子組測(cè)序結(jié)合cDNA捕獲測(cè)序鑒定非同義體細(xì)胞突變，然后經(jīng)計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)親和力和肽結(jié)合實(shí)驗(yàn)確定MHC I類分子新抗原表位，再應(yīng)用體外誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)測(cè)定T細(xì)胞識(shí)別新抗原的能力，并證明新抗原特異性的人CD8+T細(xì)胞在小鼠模型上具有抗腫瘤作用。

4 基于腫瘤新抗原免疫治療的臨床研究

全腫瘤細(xì)胞疫苗包含了所有類型的腫瘤抗原，并可通過基因編輯增強(qiáng)這些腫瘤細(xì)胞的免疫原性或產(chǎn)生細(xì)胞因子以提高免疫效能，如2015年一項(xiàng)臨床試驗(yàn)利用此類疫苗治療晚期轉(zhuǎn)移性胰腺癌可以很大程度上提高患者生存率[35]。目前，基于腫瘤基因突變產(chǎn)生的新抗原的免疫治療方法主要包括腫瘤新抗原治療性疫苗、腫瘤新抗原特異性TIL治療等技術(shù)，均已迅速?gòu)膶?shí)驗(yàn)室研究進(jìn)入臨床治療試驗(yàn)階段，見圖2、表1。

Figure 2. Immunotherapy techniques related to tumor neoantigens.

圖2 腫瘤新抗原相關(guān)的免疫治療技術(shù)

表1 腫瘤新抗原相關(guān)的臨床試驗(yàn)

EPCD: estimated primary completion date.

腫瘤新抗原治療性疫苗的形式可以是多肽或其編碼RNA或DNA分子。2017年，Ott等[2]和Sahin[3]2個(gè)研究團(tuán)隊(duì)在《Nature》期刊上同時(shí)發(fā)表臨床研究論文，首次表明基于腫瘤樣本測(cè)序和新抗原預(yù)測(cè)的個(gè)體化RNA疫苗和多肽疫苗在晚期黑色素瘤患者身上可有效抑制腫瘤進(jìn)展。2018年美國(guó)波士頓Dana-Farber癌癥中心團(tuán)隊(duì)又利用多肽腫瘤新抗原疫苗對(duì)8例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者進(jìn)行了治療，結(jié)果顯示在注射期間未接受地塞米松治療的患者產(chǎn)生了針對(duì)新抗原的CD4+和CD8+T細(xì)胞，證明了新抗原疫苗可以激活膠質(zhì)母細(xì)胞瘤這類腫瘤突變負(fù)荷低、腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞少的“冷”腫瘤的免疫反應(yīng)[8]。

腫瘤新抗原特異性TILs治療是體外擴(kuò)增腫瘤新抗原特異的腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞后回輸患者的抗癌療法。2016年Tran等[42]報(bào)道了一例轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌患者在接受此療法后，7個(gè)肺轉(zhuǎn)移灶明顯縮小。具體方法是從患者切除的轉(zhuǎn)移灶中提取TILs，分選出識(shí)別KRAS G12D突變的、HLA-C*08:02限制性的TILs，體外擴(kuò)增后回輸病人。但治療9個(gè)月后有一個(gè)轉(zhuǎn)移灶復(fù)發(fā)，經(jīng)測(cè)序發(fā)現(xiàn)此處轉(zhuǎn)移灶丟失了HLA-C*08:02編碼基因發(fā)生了免疫逃逸。此外，目前有關(guān)CAR/TCR-T細(xì)胞免疫療法治療腫瘤的臨床試驗(yàn)正在廣泛開展中，其中CAR-T臨床試驗(yàn)的主要靶點(diǎn)有CD19、HER2、MUC1和EGFRvIII等，TCR-T臨床試驗(yàn)的主要靶點(diǎn)有MART-1、gp100、CEA、NY-ESO-1、MAGE-A3和MAGE-A4等[43]。這些靶點(diǎn)屬于腫瘤相關(guān)抗原，所以在不同腫瘤類型中治療效果差別較大。未來基于腫瘤新抗原的T細(xì)胞治療技術(shù)有可能改善免疫治療的特異性。

同時(shí)，基于腫瘤新抗原的免疫療法已被證實(shí)可與抗腫瘤藥物產(chǎn)生協(xié)同作用，包括PD-1/PD-L1/CTLA-4免疫檢查點(diǎn)抑制劑[13, 39, 44-47]?？赡艿臋C(jī)制是注射腫瘤新抗原疫苗后激活患者免疫系統(tǒng),促進(jìn)腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞分泌IFN-γ，使得腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞表面產(chǎn)生PD-1/PD-L1/CTLA-4等抑制分子，因此與免疫檢查點(diǎn)抗體聯(lián)用，可有效增強(qiáng)新抗原治療療效。

5 問題和展望

雖然目前基于腫瘤新抗原的免疫治療的臨床試驗(yàn)中存在腫瘤類型和患者例數(shù)較少以及實(shí)驗(yàn)對(duì)照等問題[40, 48]，但最近完成的臨床試驗(yàn)所展示的顯著療效預(yù)示著基于腫瘤新抗原的免疫療法，無論是單獨(dú)使用還是與其它療法聯(lián)合使用，都具有重要的應(yīng)用前景。但在其廣泛應(yīng)用于腫瘤臨床治療還有較多挑戰(zhàn)。例如，如何從腫瘤組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)的大量突變中快速、準(zhǔn)確鑒定具有較強(qiáng)免疫性的新抗原以及篩選反應(yīng)性T細(xì)胞仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)，包括還需要改進(jìn)未來的組學(xué)測(cè)序技術(shù)和抗原表位預(yù)測(cè)技術(shù)，找到候選新抗原體外驗(yàn)證需要的合適的HLA基因型細(xì)胞模型，以及T細(xì)胞受體測(cè)序和鑒定候選新抗原響應(yīng)的TILs的分離、擴(kuò)增和監(jiān)測(cè)技術(shù)等；另一方面的挑戰(zhàn)是腫瘤新抗原的高度異質(zhì)性，每位腫瘤患者均需經(jīng)歷從樣本測(cè)序到疫苗或細(xì)胞制備的個(gè)體化程序，因此需要縮短治療性疫苗或細(xì)胞制備時(shí)間以盡快應(yīng)用于患者。最后，探索最優(yōu)化的個(gè)體化腫瘤新抗原組合或“off-the-shelf”新抗原產(chǎn)品、確定最適合治療的腫瘤類型、以及通過預(yù)測(cè)腫瘤患者的治療響應(yīng)來制定免疫治療和聯(lián)合治療方案將是未來基于腫瘤新抗原的免疫治療研究和應(yīng)用的重要方向。