彭雯雯， 劉國(guó)英， 潘燕霞， 趙曉霖

(福建醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)與工程學(xué)院康復(fù)治療學(xué)系， 福建 福州 350004)

中樞氧化應(yīng)激是高血壓發(fā)生發(fā)展的病理生理機(jī)制，血管緊張素II(angiotensin II，Ang II)是刺激活性氧生成的關(guān)鍵因素[1-2]。然而，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(angiotensin-converting enzyme 2，ACE2)能降解Ang II生成為血管緊張素(1-7)[angiotensin(1-7)，Ang(1-7)]，后者與MAS受體結(jié)合拮抗Ang II作用[3]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，高血壓大鼠延髓心血管中樞ACE2降低，而過(guò)表達(dá)ACE2則降低血壓[4]。中樞ACE2過(guò)表達(dá)還可阻止Ang II介導(dǎo)的升壓反應(yīng)[5]。在Ang II誘導(dǎo)的高血壓小鼠，過(guò)表達(dá)ACE2基因延緩高血壓進(jìn)展[6]。中樞ACE2在心血管疾病(高血壓和慢性心衰)中的作用日益受到重視[7]。研究表明，ACE2降壓作用與其抑制中樞交感神經(jīng)活動(dòng)[6, 8]、減輕氧化應(yīng)激[7-8]、增強(qiáng)壓力反射功能[6-7]等有關(guān)。自發(fā)性高血壓大鼠過(guò)表達(dá)ACE2能降低心臟、腎臟和動(dòng)脈內(nèi)活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)水平[5]；相反，ACE2基因敲除加劇Ang II灌注所致腦內(nèi)活性氧水平升高，過(guò)表達(dá)ACE2則降低腦內(nèi)ROS水平，抑制還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)表達(dá)，從而降低血壓[8]。

盡管ACE2能對(duì)抗Ang II誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，在高血壓和心力衰竭等心血管疾病中發(fā)揮重要作用，但ACE2引起氧化應(yīng)激的通路尚未完全清楚。由于在整體動(dòng)物，ACE2的作用受到神經(jīng)和激素因素的影響，所以本研究在體外培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞Neuro-2A，將攜帶ACE2基因的慢病毒轉(zhuǎn)染神經(jīng)細(xì)胞，探討過(guò)表達(dá)ACE2對(duì)Ang II誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的影響及其作用機(jī)制，為ACE2作為心腦血管疾病新的治療靶標(biāo)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞和材料

小鼠腦神經(jīng)母細(xì)胞瘤Neuro-2A細(xì)胞購(gòu)買于中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。DMEM高糖培養(yǎng)液和胰酶(含EDTA)購(gòu)自HyClone；胎牛血清購(gòu)自GEMINI；ACE2重組慢病毒載體(lentil-ACE2-eGFP)和慢病毒空載體攜帶綠色熒光蛋白(lentil-eGFP)由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)有限公司構(gòu)建。AngⅡ、A779和dihydroethidium (DHE)購(gòu)自MCE；Ang(1-7) ELISA試劑盒購(gòu)自武漢華美生物科技有限公司；兔單克隆ACE2、AT1受體、NADPH氧化酶(NADPH oxidase, NOX)2和NOX4抗體購(gòu)自Abcam；兔多克隆MAS抗體購(gòu)自Alomone；兔多克隆p47phox和p67phox抗體購(gòu)自Abcam；兔單克隆GAPDH抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG-HRP等購(gòu)自北京鼎國(guó)公司；Alexa Fluor 594標(biāo)記山羊抗兔IgG購(gòu)自Abcam。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) Neuro-2A細(xì)胞在含10%胎牛血清、1.0×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)傳代培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞均為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。待培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)細(xì)胞融合度達(dá)80%以上時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)在第3代細(xì)胞上進(jìn)行。

2.2ACE2基因重組慢病毒載體構(gòu)建ACE2基因重組慢病毒表達(dá)載體由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)有限公司構(gòu)建。ACE2基因全長(zhǎng)2 459 bp，序列號(hào)為NM_021804。利用PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增人源ACE2cDNA片段，引物序列為：正義序列5’-GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGTCAAGCTCTTCCTGGCTCC-TTC-3’；反義序列5’-TCCTTGTAGTCCATACCAAAGGAGGTCTGAACATCATCAGTG-3’。將擴(kuò)增的人源ACE2基因片段與慢病毒載體GV358進(jìn)行同源重組，酶切克隆位點(diǎn)為AgeI/AgeI，形成目的基因慢病毒為GV358-ACE2。陽(yáng)性克隆測(cè)序證實(shí)測(cè)序結(jié)果與GenBank網(wǎng)站上人源ACE2序列一致。將連接成功的GV358-ACE2慢病毒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，通過(guò)抽提病毒、濃縮和病毒滴度測(cè)定，最終獲得ACE2重組慢病毒的滴度為5×1011TU/L。

2.3 實(shí)驗(yàn)分組 Neuro-2A細(xì)胞接種36 h，細(xì)胞達(dá)到50%～60%融合時(shí)，慢病毒載體和重組ACE2以感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection, MOI)=10加入培養(yǎng)液中，培養(yǎng)10 h后棄去病毒液，加入新鮮的正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)96 h提取細(xì)胞總蛋白。實(shí)驗(yàn)共分為7組：空白對(duì)照(control)組、慢病毒載體(eGFP)組、重組ACE2(ACE2-eGFP)組、Ang II刺激(Ang II)組、Ang II+慢病毒載體(Ang II-eGFP)組、Ang II+重組 ACE2(Ang II-ACE2-eGFP)組和Ang Ⅱ+重組ACE2+A779(Ang II-ACE2-eGFP-A779)組。

空白對(duì)照組不做任何處理。eGFP組和ACE2-eGFP組均以MOI=10將慢病毒轉(zhuǎn)染神經(jīng)細(xì)胞。

Ang II干預(yù)組: 預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)，以終濃度為1 000、100、10和1 nmol/L的AngⅡ孵育細(xì)胞24 h后檢測(cè)AT1受體蛋白水平，以此確定AngⅡ最佳濃度為100 nmol/L[9]。

A779干預(yù)組：Ang(1-7)拮抗劑A779以終濃度為10 μmol/L加入培養(yǎng)液預(yù)處理30 min后，與AngⅡ共刺激細(xì)胞24 h。

2.4 Neuro-2A細(xì)胞的組織學(xué)鑒定 用鑷子取出6孔板中的細(xì)胞爬片，預(yù)溫37 ℃的PBS洗滌2次。預(yù)溫37 ℃的4%多聚甲醛固定細(xì)胞20 min，PBS洗3次，每次5 min。 0.2% Triton透化15 min，PBS洗3次，每次5 min。5%羊血清室溫封閉1 h，甩干，勿洗。 滴加適量兔抗NeuN抗體(1 200)于蓋玻片上，4 ℃孵育過(guò)夜。PBS洗滌3次，每孔2 mL，每次5 min。滴加適量Alexa Fluor 594 標(biāo)記的羊抗兔 IgG(1500)于蓋玻片上，室溫避光孵育2 h。PBS洗滌3次，每次5 min。滴加適量抗熒光淬滅劑避光孵育5 min, 吸除多余抗熒光淬滅劑，中性樹脂封片，應(yīng)用正置熒光顯微鏡進(jìn)行觀察并拍照。

2.5ACE2重組慢病毒轉(zhuǎn)染Neuro-2A細(xì)胞 選用第3代生長(zhǎng)狀態(tài)良好的神經(jīng)細(xì)胞，按照5×107/L細(xì)胞密度接種2 mL到6孔板中。待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至孔底面積的50%左右時(shí)，更換為無(wú)血清的DMEM饑餓培養(yǎng)12 h。慢病毒以MOI為10感染Neuro-2A細(xì)胞10 h后，棄去病毒液，更換為完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。病毒感染72 h后，通過(guò)熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白表達(dá)情況。感染96 h后，使用細(xì)胞裂解液提取總蛋白。

2.6 原位檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平 Neuro-2A細(xì)胞按照每孔2.5×104個(gè)細(xì)胞密度接種到24孔板中，加入lentil-eGFP和lentil-ACE2-eGFP進(jìn)行轉(zhuǎn)染，72 h后加入AngⅡ(100 nmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)24 h。96 h后棄去舊培養(yǎng)液，室溫下PBS漂洗3次,加入含有2 μmol/L DHE熒光探針的DMEM培養(yǎng)液500 μL，37 ℃避光孵育30 min，繼續(xù)用PBS洗滌細(xì)胞3次，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。利用ImageJ軟件進(jìn)行熒光強(qiáng)度分析。

2.7 ELISA法測(cè)定Ang(1-7)水平 Neuro-2A細(xì)胞加入裂解液提取細(xì)胞蛋白，4 ℃、13 500×g離心20 min，取上清放入新的EP管中。采用ELISA試劑盒(CSB-E13763m)測(cè)定Ang(1-7)水平，按照說(shuō)明書步驟進(jìn)行操作[5]。

2.8 ACE2、MAS受體和NADPH氧化酶蛋白水平檢測(cè) 收集各組細(xì)胞，預(yù)冷PBS沖洗2次，加入細(xì)胞裂解液(RIPA PMSF 蛋白酶抑制劑=100 1 1)，冰上裂解30 min，4 ℃、13 500×g離心20 min，上清為細(xì)胞總蛋白。采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。取30 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳(10%分離膠)、濕轉(zhuǎn)恒壓100 V，5%的脫脂奶粉室溫下封閉1 h，分別孵育兔抗ACE2、p47phox、p67phox(1 1 000)及兔抗MAS、NOX2、NOX4(1 2 000)，4 ℃搖床過(guò)夜 。次日TBST洗3次，每次10 min。II抗(1 3 000)室溫?fù)u床1 h，TBST洗3次，每次10 min。加入ECL發(fā)光液進(jìn)行顯色、曝光。利用ImageJ軟件進(jìn)行灰度值分析，以GAPDH作為內(nèi)參照，結(jié)果采用目的蛋白與GAPDH蛋白比值表示。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

上述每個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次以上，全部數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用SPSS 20.0軟件系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，再采用最小顯著性差異法(LSD法)進(jìn)行兩兩比較，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 體外培養(yǎng)Neuro-2A細(xì)胞鑒定及 ACE2基因轉(zhuǎn)染

神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志物神經(jīng)元核抗原(neuronal nuclear antigen,NeuN)在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)紅色。圖1A可見Neuro-2A細(xì)胞胞漿呈紅色，證明為神經(jīng)細(xì)胞。慢病毒載體上攜帶綠色熒光蛋白，重組ACE2轉(zhuǎn)染神經(jīng)細(xì)胞72 h后，圖1B顯示80%以上的細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光，說(shuō)明ACE2基因成功導(dǎo)入神經(jīng)細(xì)胞中。圖1C是A和B的重疊，提示導(dǎo)入ACE2基因的細(xì)胞是神經(jīng)細(xì)胞。慢病毒載體和重組ACE2以MOI =10感染Neuro-2A細(xì)胞72 h后，圖1D顯示空白對(duì)照組和慢病毒載體組不表達(dá)ACE2蛋白，ACE2基因?qū)虢MACE2蛋白水平為空白對(duì)照組的1.45±0.31倍(P<0.05)。

2 AngⅡ干預(yù)對(duì)AT1受體蛋白表達(dá)的影響

AT1受體蛋白表達(dá)水平隨AngⅡ濃度升高而增加，呈現(xiàn)濃度依賴性，AT1受體蛋白較空白組顯著增加(P<0.05)，其中100 nmol/L組的AT1受體蛋白表達(dá)達(dá)到峰值，故作為本實(shí)驗(yàn)后續(xù)的干預(yù)濃度,見圖2。

3 ACE2過(guò)表達(dá)對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的ROS水平的影響

重組ACE2基因轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞，其ROS水平與空白對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05)。AngⅡ刺激顯著升高ROS 水平(P<0.01)，但ACE2基因過(guò)表達(dá)能抑制AngⅡ引起的ROS水平升高(P<0.01)，ACE2基因轉(zhuǎn)染+AngⅡ組ROS顯著低于Ang II處理組(P<0.05)，見圖3。

Figure 1. Identification of the Neuro-2A cells andACE2gene transfection. A: NeuN positive cells (red); B:ACE2-transfected cells (green); C: merged image of A and B; D: ACE2 protein expression afterACE2transfection. The scale bar=50 μm. Mean±SD.n=4.*P<0.05vsthe control or eGFP group.

圖1 Neuro-2A 細(xì)胞鑒定及ACE2基因轉(zhuǎn)染

Figure 2. The effects of various concentrations of Ang II on AT1 receptor protein expression in the Neuro-2A cells. Mean±SD.n=4.*P<0.05vs0 nmol/L;#P<0.05vs1 nmol/L;$P<0.05vs10 nmol/L.

圖2 Ang II誘導(dǎo)Neuro-2A細(xì)胞AT1受體蛋白表達(dá)的量效關(guān)系

Figure 3. The changes of reactive oxygen species in the Neuro-2A cells (DHE staining). The scale bar=50 μm. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vseGFP+Ang II group.

圖3 DHE 染色顯示Neuro-2A細(xì)胞內(nèi)活性氧變化

4 ACE2過(guò)表達(dá)對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的NADPH氧化酶的影響

空白對(duì)照組和慢病毒載體組的NOX2、NOX4、p47phox和p67phox蛋白表達(dá)無(wú)顯著差異。AngⅡ處理組NOX2、NOX4、p47phox和p67phox的蛋白表達(dá)顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，ACE2基因過(guò)表達(dá)則抑制AngⅡ誘導(dǎo)NOX2、NOX4、p47phox和p67phox的蛋白表達(dá)(P<0.01)。慢病毒載體不影響AngⅡ上調(diào)NOX2、NOX4、p47phox和p67phox蛋白表達(dá)的作用，見圖4。

Figure 4. The effect ofACE2over-expression on the protein expression of NADPH oxidase (NOX) in the Neuro-2A cells. Mean±SD.n=4.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vseGFP+Ang II group.

圖4ACE2過(guò)表達(dá)對(duì)Neuro-2A細(xì)胞NADPH氧化酶蛋白表達(dá)的影響

5 ACE2過(guò)表達(dá)對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的Ang(1-7)水平的影響

空白對(duì)照組、慢病毒載體組和ACE2-eGFP組的Ang(1-7)水平無(wú)顯著差異(P>0.05)。AngⅡ處理組或病毒空載體+Ang II組也不影響Ang(1-7)水平(P>0.05)，但ACE2-eGFP+AngⅡ組Ang(1-7)水平顯著升高于空白對(duì)照組和AngⅡ處理組(P<0.05)，見圖5A。

6 ACE2過(guò)表達(dá)對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的MAS蛋白表達(dá)的影響

空白對(duì)照組、慢病毒載體組和重組ACE2組，3組MAS蛋白表達(dá)無(wú)顯著差異(P>0.05)。AngⅡ處理顯著下調(diào)MAS蛋白表達(dá)(P<0.01)，慢病毒載體+Ang II組MAS蛋白表達(dá)也顯著低于空白對(duì)照組(P<0.05)， ACE2-eGFP+AngⅡ組MAS蛋白表達(dá)較單獨(dú)Ang II處理組顯著上調(diào)(P<0.05)，見圖5B。

7 Ang(1-7)受體拮抗劑對(duì)NADPH氧化酶的影響

與空白對(duì)照組相比，AngⅡ處理顯著增強(qiáng)NOX2、NOX4、p47phox和p67phox蛋白表達(dá)(P<0.01)。ACE2基因過(guò)表達(dá)則顯著降低AngⅡ介導(dǎo)的NOX2、NOX4、p47phox和p67phox蛋白表達(dá)(P<0.05)，但這種作用可以被MAS受體拮抗劑A779所阻斷(P<0.05)，見圖6。

討 論

ACE2是血管緊張素轉(zhuǎn)換酶的同源物，但作用與其相反。ACE2主要作用是降解Ang II生成Ang(1-7)，一方面Ang II水平降低，能改善與Ang II相關(guān)的疾??；另一方面，Ang (1-7)水平升高，對(duì)Ang II產(chǎn)生負(fù)性調(diào)節(jié)作用[10]。因此，ACE2能調(diào)節(jié)Ang II/Ang (1-7)平衡。在整體水平，ACE2基因功能受到神經(jīng)和其體液因素影響。為研究ACE2基因在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中作用及其下游信號(hào)通路，本實(shí)驗(yàn)選用培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞，探討ACE2過(guò)表達(dá)對(duì)Ang II誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的影響及其介導(dǎo)因素。Neuro-2A細(xì)胞是腦神經(jīng)瘤細(xì)胞，主要用于研究神經(jīng)細(xì)胞的分化、軸突生長(zhǎng)及中樞信號(hào)通路等。它含有腎素-血管緊張素系統(tǒng)大多數(shù)成分，如腎素、Ang II和AT1受體等, 但ACE2含量非常少。若沒(méi)有外來(lái)刺激，幾乎無(wú)法檢測(cè)到ACE2蛋白表達(dá)。因此，Neuro-2A細(xì)胞是研究ACE2基因功能的理想模型[11]。本實(shí)驗(yàn)采用同源重組技術(shù)構(gòu)建攜帶ACE2和eGFP雙基因的慢病毒載體，并轉(zhuǎn)染Neuro-2A細(xì)胞，在熒光顯微鏡下，Neuro-2A細(xì)胞檢測(cè)到綠色熒光，說(shuō)明ACE2基因已成功進(jìn)入Neuro-2A細(xì)胞。NeuN是神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志物[12]，采用免疫熒光技術(shù)對(duì)Neuro-2A細(xì)胞進(jìn)行染色，Neuro-2A細(xì)胞在熒光顯微鏡下也檢測(cè)紅色熒光，從而證實(shí)ACE2成功導(dǎo)入的Neuro-2A細(xì)胞是神經(jīng)細(xì)胞。Western blot 顯示神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)ACE2蛋白高表達(dá)，進(jìn)一步證明ACE2成功導(dǎo)入神經(jīng)細(xì)胞，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

Figure 5. The effect ofACE2over-expression on Ang(1-7) level (A) and MAS protein expression (B) in Neuro-2A cells. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vseGFP+Ang II group.

圖5ACE2過(guò)表達(dá)對(duì)Neuro-2A細(xì)胞Ang(1-7)水平和MAS蛋白表達(dá)的影響

Figure 6. Effects of MAS receptor antagonist A779 on the protein expression of NADPH oxidase in the Neuro-2A cells. Mean±SD.n=4.*P<0.05，**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsAng II group;$P<0.05vsACE2-eGFP+Ang II group.

圖6 MAS受體拮抗劑A779對(duì)Neuro-2A細(xì)胞NADPH氧化酶表達(dá)的影響

Ang II是引起細(xì)胞氧化應(yīng)激的主要刺激物[13]，本實(shí)驗(yàn)在培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞加入100 nmol/L Ang II，細(xì)胞內(nèi)ROS水平較空白對(duì)照組增加了(10.26±1.9)倍，ACE2基因顯著抑制Ang II 誘導(dǎo)的ROS水平升高。在培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞，ACE2基因過(guò)表達(dá)也產(chǎn)生抑制細(xì)胞氧化應(yīng)激的作用[14]。細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高主要來(lái)自NADPH氧化酶激活[15- 16]。正常情況下NADPH氧化酶由胞膜上NOX2(gp91phox)和p22phox亞基，以及胞漿p47phox和p67phox亞基組成，胞膜上亞基與胞漿亞基分離，NADPH氧化酶沒(méi)有活性。但在Ang II刺激下，胞漿內(nèi)亞基活化，并轉(zhuǎn)位到胞膜上，與胞膜上亞基結(jié)合，激活NADPH氧化酶，導(dǎo)致ROS生成增多[2]。本研究也觀察到，在Ang II刺激下，NADPH氧化酶NOX2、NOX4、p47phox和p67phox亞基蛋白表達(dá)均上調(diào)，顯著高于空白對(duì)照組，但ACE2基因過(guò)表達(dá)則顯著抑制Ang II誘導(dǎo)的NOX2、NOX4、p47phox和p67phox表達(dá)。ACE2基因以慢病毒為載體，本研究結(jié)果顯示，慢病毒載體不影響Ang II對(duì)NADPH氧化酶的刺激作用。在沒(méi)有Ang II刺激情況下，單獨(dú)ACE2基因過(guò)表達(dá)也不影響NADPH氧化酶亞基的表達(dá)。在培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞，AngⅡ刺激明顯增加NADPH氧化酶亞基p22phox的表達(dá)，而ACE2基因過(guò)表達(dá)則明顯抑制p22phox表達(dá)[14]。此外，ROS水平升高還與NADPH氧化酶激活有關(guān)。Zhong等[17]報(bào)道Ang II能增強(qiáng)NADPH氧化酶活性，促進(jìn)ROS生成增加。若敲除ACE2基因則增加腎臟ROS水平和NADPH氧化酶活性[18]。上述研究結(jié)果表明ACE2過(guò)表達(dá)通過(guò)抑制NADPH氧化酶表達(dá)和活性而減輕Ang II誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。

為了明確介導(dǎo)ACE2作用的下游信號(hào)通路，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Ang(1-7)水平和MAS受體表達(dá)。結(jié)果表明，Neuro-2A細(xì)胞內(nèi)Ang(1-7)較低水平, 給予 Ang II刺激后，Ang(1-7)水平無(wú)明顯變化，這與Zhang等[19]結(jié)果不一樣，Zhang等[19]報(bào)道Ang II刺激后，內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)Ang(1-7)水平明顯下降。造成這個(gè)差異可能由于內(nèi)皮細(xì)胞存在內(nèi)源性ACE2，Ang II刺激后，Ang II濃度升高抑制ACE2酶活性，導(dǎo)致Ang(1-7)生成減少。而Neuro-2A細(xì)胞幾乎測(cè)不到內(nèi)源性ACE2，加入Ang II對(duì)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Ang(1-7)水平無(wú)明顯影響。然而，神經(jīng)細(xì)胞過(guò)表達(dá)ACE2后，Ang II刺激不僅不能降低Ang(1-7)，反而顯著提高Ang(1-7)水平。其可能原因是，外源性Ang II濃度高于生理水平，ACE2過(guò)表達(dá)使Ang II分解為Ang(1-7)增多，從而提高神經(jīng)細(xì)胞Ang(1-7)水平。Lo等[5]報(bào)道正常大鼠灌注Ang II，引起血漿Ang II水平升高，Ang(1-7)水平降低，ACE2過(guò)表達(dá)則升高血漿Ang(1-7)。本實(shí)驗(yàn)ACE2過(guò)表達(dá)取消了Ang II抑制MAS受體表達(dá)的作用，MAS受體蛋白水平恢復(fù)，接近于空白對(duì)照組水平。同樣地，Sriramula等[20]在Ang II灌注誘導(dǎo)高血壓大鼠模型中，Ang II灌注下調(diào)ACE2和MAS受體表達(dá)，而ACE2過(guò)表達(dá)則上調(diào)MAS受體表達(dá)。若無(wú)Ang II刺激，ACE2基因過(guò)表達(dá)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞Ang(1-7)和MAS受體無(wú)明顯影響。這說(shuō)明ACE2過(guò)表達(dá)對(duì)正常情況無(wú)明顯影響，但能夠?qū)笰ng II作用。

為了明確ACE2抑制NADPH氧化酶表達(dá)是否由MAS受體介導(dǎo)的，本研究在ACE2過(guò)表達(dá)的神經(jīng)細(xì)胞加入MAS受體阻斷劑A779，與Ang II共同處理神經(jīng)細(xì)胞，結(jié)果表明A779取消了ACE2抑制NADPH氧化酶亞基表達(dá)的作用，A779組NOX2、NOX4、p47phox和p67phox等蛋白表達(dá)升高，接近于單純AngⅡ處理組，這一結(jié)果提示ACE2下調(diào)NADPH氧化酶表達(dá)是通過(guò)MAS受體介導(dǎo)的。在培養(yǎng)的脂肪細(xì)胞，Liu等[21]證實(shí)Ang(1-7)可以降低NADPH氧化酶水平，抑制氧化應(yīng)激，而MAS受體阻斷劑A779可拮抗Ang(1-7)的作用。

綜上所述，在Ang II誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的神經(jīng)細(xì)胞，ACE2基因過(guò)表達(dá)通過(guò)MAS受體介導(dǎo)減輕細(xì)胞氧化應(yīng)激，這一作用與NADPH氧化酶表達(dá)降低有關(guān)。