吳源周， 王秋平， 肖 丹， 朱亞如， 方 舜△

(南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院 1心胸外科， 2病理科， 廣東 廣州 510280)

肺癌患者術(shù)后的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是影響肺癌患者整體預(yù)后的重要因素，也是導(dǎo)致肺癌進(jìn)展、致死的主要原因，嚴(yán)重影響患者的療效和生存質(zhì)量[1]。目前研究表明，腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells，CSCs)的激活和增多過程在肺癌等惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)中具有重要作用，因此探尋肺癌干細(xì)胞調(diào)控的相關(guān)分子，開發(fā)可以有效抑制肺癌CSCs的治療手段，對抑制肺癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，改善肺癌總體療效具有重要的臨床應(yīng)用價值[2]。本團(tuán)隊前期研究發(fā)現(xiàn)，let-7a-3p可能具有對腫瘤干細(xì)胞的確切抑制效果，有望成為肺癌的惡性腫瘤治療的有效手段[3]。然而，let-7a-3p對肺癌干細(xì)胞是否具有確切的抑制效果仍不明確，而且，其抑制腫瘤的起效機(jī)制也尚不明確[4]。何曉燕等[5]研究提示，let-7a-3p的同源類似物let-7a能顯著抑制肺癌細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的生長能力。這讓我們對進(jìn)一步探討let-7a-3p在肺癌中的作用及其機(jī)制產(chǎn)生了興趣。Let-7a-3p是一種來自let-7a-1或let-7a-3干環(huán)左臂的成熟微小RNA(microRNA，miRNA，miR)。另外，也有報道認(rèn)為，let-7a-3p也是let-7a-2的成熟miRNA之一，所以也被稱為let-7a-2-3p。 所以，let-7a前體經(jīng)一種核糖核酸內(nèi)切酶(Dicer酶)進(jìn)一步加工，轉(zhuǎn)化為成熟的let-7a雙鏈體，隨后由真核翻譯起始因子Argonaute 3(Ago3)介導(dǎo)產(chǎn)生let-7a-3p。本團(tuán)隊對let-7a-3p的靶基因進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測后發(fā)現(xiàn)，與多種惡性腫瘤生物學(xué)行為相關(guān)的胰島素樣生長因子1受體(insulin-like growth factor 1 receptor，IGF1R)可能是其在肺癌細(xì)胞中的作用靶蛋白。本研究首先比較了肺癌細(xì)胞與正常支氣管上皮細(xì)胞中l(wèi)et-7a-3p表達(dá)水平的差異，進(jìn)而采用let-7a-3p模擬物(let-7a-3p mimics)轉(zhuǎn)染人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞，觀察其對肺癌細(xì)胞中CSCs功能和比例的影響，并通過研究其對CSCs相關(guān)功能蛋白及IGF1R蛋白表達(dá)水平的影響，進(jìn)一步明確其分子生物學(xué)機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 材料

人肺癌細(xì)胞株A549、NCI-H1299、SPC-A1、H1650和HCC-827及人正常支氣管上皮細(xì)胞株BEAS-2B購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(American Type Culture Collection，ATCC)。DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清購自GIBCO；轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體2000購自Invitrogen；Real-time PCR逆轉(zhuǎn)錄-聚合鏈酶反應(yīng)試劑盒購自TaKaRa；兔抗人IGF1R、NANOG、OCT4、和GAPDH抗體購自Abcam；let-7a-3p mimics及其陰性對照(negative control mimic)、let-7a-3p及內(nèi)參照U6的PCR引物購自廣州亞科生物技術(shù)有限公司；雙螢光素酶檢驗試劑盒、野生型的WT-IGF1R-3’-UTR載體、3’-UTR定點突變后的MT-IGF1R-3’UTR載體及IGF1R過表達(dá)質(zhì)粒購自購自廣州松楊生物技術(shù)有限公司。

2 方法

2.1 miRNA轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染前后各組細(xì)胞系中l(wèi)et-7a-3p水平的RT-qPCR檢測 以含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)A549、NCI-H1299、SPC-A1、H1650、HCC-827和BEAS-2B細(xì)胞。按照轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體2000試劑說明書，在細(xì)胞融合度約60%～70%時以miRNA mimics終濃度為75 nmol/L轉(zhuǎn)染let-7a-3p mimics和negative control mimic，分別作為let-7a-3p組和negative control組， 轉(zhuǎn)染48 h；以未轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞作為對照(non-transfected)組。提取各組總細(xì)胞RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以U6 作為內(nèi)參照，進(jìn)行RT-qPCR檢測。PCR條件按照課題組既往報道方法進(jìn)行，所得數(shù)據(jù)用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析計算。Let-7a-3p的上游引物序列為5’-GCGCGTAGTCTGAGAGGTTG-3’, 下游引物序列為5’-CCAGGGAGTGTCCGAGGT-3’；U6的上游引物序列為5’-CTCCGGCGCTTAGCACA-3’，下游引物序列為5’-AACTTACGAATCGCTTGCGT-3’。

2.2 瘤球形成實驗檢測腫瘤干細(xì)胞特性 分別取轉(zhuǎn)染后各組肺癌A549細(xì)胞，胰酶消化，反復(fù)PBS洗滌離心后，采用DMEM高糖培養(yǎng)基重懸制成1×108/L的單細(xì)胞懸液。取低吸附6孔板，每孔加入細(xì)胞懸液2 mL細(xì)胞懸液，同前培養(yǎng)條件培養(yǎng)。12 d后計數(shù)培養(yǎng)板中出現(xiàn)的懸浮、透亮細(xì)胞球數(shù)量。每組細(xì)胞鏡下隨機(jī)計數(shù)3個視野。對每組3個視野瘤球數(shù)量的平均值進(jìn)行統(tǒng)計比較。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測腫瘤干細(xì)胞比例 同前法，取轉(zhuǎn)染后各組肺癌A549細(xì)胞，胰酶消化，反復(fù)PBS洗滌離心后，PBS重懸制成1×108/L的單細(xì)胞懸液。同本團(tuán)對研究報道方法[3]，加入CD133-FITC 熒光抗體避光孵育0.5 h 后，流式細(xì)胞術(shù)檢測CD133 陽性細(xì)胞率。

2.4 Let-7a-3p靶基因預(yù)測 運(yùn)用生物信息學(xué)方法在miRBase數(shù)據(jù)庫中搜索let-7a-3p的序列, 進(jìn)而分析let-7a-3p序列的特征并預(yù)測其可能的靶基因[6]。

2.5 Western blot法檢測細(xì)胞蛋白表達(dá)的變化 肺癌細(xì)胞分組轉(zhuǎn)染后48 h，按照既往報道方法[3]收集細(xì)胞，提取總蛋白，用Western blot法檢測IGF1R、NANOG和OCT4的蛋白水平，以GAPDH為內(nèi)參照。

2.6 雙螢光素酶實驗檢測let-7a-3p與IGF1R的關(guān)系 采用野生型的IGF1R psiCHECKTM-2載體及定點突變后的IGF1R psiCHECKTM-2載體，分別和let-7a-3p mimics一起通過脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48 h后行雙螢光素酶活性檢測[3]。

2.7 IGF1R過表達(dá)對let-7a-3p抑制CSCs的拮抗作用 采用IGF1R過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染let-7a-3p組A549細(xì)胞系，并通過Western blot檢測IGF1R過表達(dá)后let-7a-3p組細(xì)胞中相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。

2.8 建立皮下移植瘤模型，觀察let-7a-3p對體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的抑制作用 同本課題組前期研究報道的方法[7]，將經(jīng)過慢病毒包裝的let-7a-3p質(zhì)粒和經(jīng)過慢病毒包裝的negative control對照質(zhì)粒感染肺癌A549細(xì)胞。經(jīng)嘌呤霉素篩選，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。無免疫力的BALB/c裸鼠飼養(yǎng)于南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心SPF環(huán)境下，動物合格證號為SCXK (粵) 2012-0002。分別收集3組對數(shù)生長期的細(xì)胞1×106個，于裸鼠左脅部皮下注射建立皮下移植瘤，設(shè)定21 d為觀察終點，取出移植瘤進(jìn)行觀察。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析。實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較用單因素方差分析(one-way ANOVA)，方差分析后各組均數(shù)間的兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗。以P<0.01為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 肺癌細(xì)胞系和正常支氣管上皮細(xì)胞系中l(wèi)et-7a-3p表達(dá)水平的比較

采用RT-qPCR法檢測肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、NCI-H1299、SPC-A1、H1650和HCC-827及正常支氣管上皮細(xì)胞系BEAS-2B中l(wèi)et-7a-3p表達(dá)水平后發(fā)現(xiàn)，肺癌細(xì)胞系中l(wèi)et-7a-3p表達(dá)水平均明顯低于正常支氣管上皮細(xì)胞系(P<0.01)，見圖1。

Figure 1. Relative expression level of let-7a-3p in the lung can-cer cell lines and normal bronchial epithelial cell line was detected by RT-pCR. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsBEAS-2B cells.

圖1 肺癌細(xì)胞系和正常支氣管上皮細(xì)胞系中l(wèi)et-7a-3p表達(dá)水平檢測

2 轉(zhuǎn)染后A549細(xì)胞let-7a-3p表達(dá)水平的變化

分組轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞48 h后，分別檢測3組細(xì)胞中l(wèi)et-7a-3p的表達(dá)水平，結(jié)果顯示let-7a-3p組的let-7a-3p表達(dá)水平明顯上調(diào)(P<0.01)，而negative control組的let-7a-3p表達(dá)水平與non-transfected組的差異沒有統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖2。

3 Let-7a-3p對A549細(xì)胞中的腫瘤干細(xì)胞潛能的影響

瘤球形成實驗發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過12 d的培養(yǎng)，可觀察到懸浮、透亮細(xì)胞球形成。研究發(fā)現(xiàn)let-7a-3p組瘤球數(shù)量明顯低于non-transfected組(P<0.01)，而negative control組與non-transfected組之間瘤球數(shù)量的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖3。

Figure 2. The expression levels of Let-7a-3p in the A549 cells after transfection. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsnon-transfected group.

圖2 轉(zhuǎn)染后A549細(xì)胞中的let-7a-3p水平

4 Let-7a-3p對A549細(xì)胞中腫瘤干細(xì)胞比例的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)， let-7a-3p組的CD133+細(xì)胞比例[(0.32±0.03)%]明顯低于non-transfected組[(2.37±0.36)%，P<0.01]，而negative control組的CD133+細(xì)胞比例[(2.42±0.45)%]與non-transfected組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性(P>0.05)，見圖4。

5 Let-7a-3p對A549細(xì)胞中CSCs相關(guān)功能蛋白表達(dá)的影響

Western blot實驗顯示，與non-transfected組相比，let-7a-3p組NANOG蛋白和OCT4蛋白表達(dá)量明顯降低(P<0.01)，而negative control組與對照組之間的蛋白表達(dá)的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖5。

6 Let-7a-3p靶基因的預(yù)測及與靶基因相互作用關(guān)系的雙螢光素酶實驗檢測

miRBase生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果表明，let-7a-3p與IGF1R的3’-UTR部分互補(bǔ)，IGF1R可能是let-7a-3p的靶基因，見圖6。進(jìn)一步構(gòu)建3’-UTR定點突變型MUT-IGF1R-3’UTR載體和野生型WT-IGF1R-3’UTR載體，在let-7a-3p共轉(zhuǎn)染條件下，進(jìn)行雙螢光素酶檢驗，結(jié)果顯示let-7a-3p能明顯抑制野生型WT-IGF1R-3’UTR載體的發(fā)光強(qiáng)度(P<0.01)，而無法抑制3’UTR定點突變型MUT-IGF1R-3’UTR載體的發(fā)光強(qiáng)度，說明IGF1R為let-7a-3p的下游靶基因，見圖7。

Figure 3. Sphere formation capacity in various groups. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsnon-transfected group.

圖3 不同處理組細(xì)胞單克隆瘤球形成能力的比較

Figure 4. The proportion of CD133+cells in different treatment groups.

圖4 不同處理組CD133+細(xì)胞比例的比較

Figure 5. The effect of let-7a-3p on the protein expression of CSCs-related functional proteins in the A549 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsnon-transfected group.

圖5 Let-7a-3p對A549細(xì)胞CSCs相關(guān)功能蛋白表達(dá)的影響

Figure 6. Target gene of let-7a-3p predicted by bioinformatic method.

圖6 生物信息學(xué)預(yù)測let-7a-3p的靶基因

7 Let-7a-3p對A549細(xì)胞IGF1R蛋白表達(dá)水平的影響

轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染含有綠色熒光蛋白表達(dá)序列的IGF1R過表達(dá)質(zhì)粒載體48 h后，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測綠色熒光蛋白陽性細(xì)胞比例為(87.52±3.06)%，與文獻(xiàn)報道的比例[8]接近，顯示轉(zhuǎn)染成功。進(jìn)一步的Western blot結(jié)果顯示，與non-transfected組相比， let-7a-3p組的IGF1R蛋白表達(dá)量明顯降低，而negative control組與對照組之間的IGF1R蛋白表達(dá)水平的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性；IGF1R蛋白表達(dá)量的Western blot結(jié)果與let-7a-3p的PCR結(jié)果表現(xiàn)出負(fù)向相關(guān)關(guān)系，這說明let-7a-3p抑制IGF1R蛋白表達(dá)的效果顯著；并且，由圖5可見，經(jīng)過IGF1R質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染之后，let-7a-3p對NANOG和OCT4等腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物的抑制作用受到明顯的拮抗，見圖5。

8 Let-7a-3p對A549細(xì)胞體內(nèi)皮下移植瘤生長能力的影響

第21 天時切取皮下移植瘤進(jìn)行觀察，可見let-7a-3p組的皮下移植瘤明顯小于non-transfected組(P<0.01)，而2個對照組之間腫瘤大小的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖8。這表明升高let-7a-3p的表達(dá)水平可以抑制A549細(xì)胞皮下成瘤的增生能力。

Figure 7. The relative luciferase activity. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsnon-transfected group.

圖7 Let-7a-3p與IGF1R相互作用關(guān)系的螢光素酶活性檢測

討 論

miRNA為相對保守的內(nèi)源性非編碼RNA，參與調(diào)控人類基因組中半數(shù)以上功能基因的表達(dá)。miRNA可以結(jié)合到靶蛋白mRNA的3’-UTR，引起靶mRNA的降解，進(jìn)而抑制目的蛋白的翻譯。目前研究顯示，miRNA參與所有惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移等過程[4]。不同的miRNA在腫瘤的生物學(xué)過程中發(fā)揮“癌miRNA”或“抑癌miRNA”的功能。Let-7a在目前抑癌miRNA研究中受到關(guān)注[3-4]。

肺癌的侵襲、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是目前肺癌患者綜合治療失敗甚至致死的主因，如何有效抑制肺癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)一直是肺癌研究的重要方向[1]。目前腫瘤干細(xì)胞理論認(rèn)為，腫瘤干細(xì)胞是惡性腫瘤組織中存在的一小群具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞，是腫瘤細(xì)胞中具有無限增殖和轉(zhuǎn)移潛能的重要亞群，是惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的重要始動因素[9]。如果能夠?qū)Ψ伟└杉?xì)胞進(jìn)行有效的基因治療抑制，可望實現(xiàn)良好的治療效果。 本團(tuán)隊在前期研究中證實，miRNA let-7a可以抑制CD133+肝癌干細(xì)胞活性，實現(xiàn)對肝癌干細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移潛能的高效抑制[3]。所以，在后續(xù)研究中，我們希望驗證let-7a對肺癌腫瘤干細(xì)胞的作用及其起效機(jī)制，以開發(fā)有效的肺癌干細(xì)胞抑制手段。

Figure 8. The effect of let-7a-3p on the volume of A549 cell subcutaneously transplanted tumors. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsnon-transfected group.

圖8 Let-7a-3p對A549細(xì)胞皮下移植瘤體積的影響

本研究證實，let-7a-3p在多種肺癌細(xì)胞中的表達(dá)量明顯低于肺正常細(xì)胞系。該結(jié)果與既往相關(guān)研究報道相符。進(jìn)而，我們采用let-7a-3p mimics轉(zhuǎn)染的方法，成功地提高了肺癌細(xì)胞中l(wèi)et-7a-3p的水平。進(jìn)而發(fā)現(xiàn)let-7a-3p水平的升高可通過對肺癌干細(xì)胞標(biāo)志物NANOG和OCT4表達(dá)水平的抑制，實現(xiàn)對肺癌干細(xì)胞的單克隆瘤球形成能力的抑制和肺癌干細(xì)胞比例的下調(diào)，表明let-7a-3p mimic具有抑制肺癌干細(xì)胞的潛能。

進(jìn)而，我們對其抑制肺癌干細(xì)胞潛能的機(jī)制進(jìn)行深入探索。通過生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，let-7a-3p與IGF1R蛋白可能存在靶向調(diào)控關(guān)系，且其熱穩(wěn)定型和基因保守性較高。但是該靶向調(diào)控關(guān)系在肺癌細(xì)胞中是否存在，仍需要進(jìn)一步的研究證明。IGF1R是一種跨膜酪氨酸受體蛋白[10]，它通過與其配體胰島素樣生長因子特異性結(jié)合誘導(dǎo)細(xì)胞有絲分裂，進(jìn)而在腫瘤細(xì)胞中，產(chǎn)生對增殖、凋亡、血管生成及侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)的調(diào)控作用[11]。IGF1R與前列腺癌、乳腺癌和肺癌等惡性腫瘤密切相關(guān)[12-13]。我們采用構(gòu)建3’-UTR突變的真核載體，進(jìn)行螢光素酶活性檢測發(fā)現(xiàn)，let-7a-3p確實通過靶向IGF1R蛋白的3’-UTR區(qū)產(chǎn)生作用，且let-7a-3p對肺癌干細(xì)胞中肺癌干細(xì)胞標(biāo)志物NANOG和OCT4表達(dá)水平的抑制作用，可以被IGF1R的真核異位表達(dá)有效拮抗。同時，我們在體內(nèi)實驗研究中初步證明了let-7a-3p在體內(nèi)對A549細(xì)胞的抑制作用。前述研究說明，在肺癌細(xì)胞中，IGF1R為let-7a-3p直接的下游靶基因，且其靶向調(diào)控作用最終產(chǎn)生了對肺癌干細(xì)胞的調(diào)控作用。

綜上所述，let-7a-3p可能通過降低下游靶基因IGF1R水平影響肺癌干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)，進(jìn)而實現(xiàn)對人肺癌A549細(xì)胞干性的抑制。該miRNA有可能成為高效肺癌基因治療的靶點。