路 倩， 趙唯安， 劉玲娟， 潘 博， 田 杰

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院心血管內(nèi)科, 兒童發(fā)育疾病研究教育部重點實驗室, 兒童發(fā)育重大疾病國家國際科技合作基地, 兒科學(xué)重慶市重點實驗室, 重慶 401122)

先天性心臟病(congenital heart disease，CHD)是胚胎時期心臟及血管發(fā)育異常導(dǎo)致形態(tài)結(jié)構(gòu)功能與循環(huán)代謝的異常。全球范圍內(nèi)，每年約有135萬～150萬的先天性心臟病患兒出生，其中約有15%左右是由明確的遺傳原因造成的[1]，而絕大多數(shù)是由環(huán)境和遺傳因素共同作用引起的，但環(huán)境因素是以何種機(jī)制與遺傳因素共同參與了先天性心臟病的發(fā)生發(fā)展尚不清楚。

表觀遺傳(epigenetic inheritance)是遺傳與環(huán)境因素間的橋梁，其介導(dǎo)了心臟的發(fā)生與構(gòu)建。既往環(huán)境因素對胚胎發(fā)育影響的研究多集中于母代孕期不良環(huán)境因素暴露，如飲酒、藥物和感染等。然而近年研究表明，父代不良環(huán)境因素暴露，尤其是父代在備孕期多種環(huán)境因素也對子代胚胎發(fā)育產(chǎn)生重要影響[2]。流行病學(xué)及模式動物研究顯示，父代飲酒可顯著增加子代先天性心臟病等多種先天性畸形發(fā)生率[3-4]。然而父代飲酒對子代心臟發(fā)育影響的機(jī)制尚不完全清楚。本文通過構(gòu)建父代飲酒致子代心臟發(fā)育異常的動物模型，檢測子代小鼠心肌細(xì)胞凋亡水平顯著升高，進(jìn)一步探討組蛋白乙?；揎椩谠摬±戆l(fā)生中的可能機(jī)制，為父代在備孕期間避免酒精暴露提供參考資料。

材 料 和 方 法

1 實驗動物及模型構(gòu)建

雄性SPF級C57小鼠，6～8周齡，18～20 g；雌性SPF級C57小鼠，8～10周齡，由重慶醫(yī)科大學(xué)動物中心提供，合格證號為SYXK(渝)2007-0016。雄性小鼠隨機(jī)分為3組，參考相關(guān)文獻(xiàn)[5]分別給予40%酒精(alcohol)組和生理鹽水(negative)組每日灌胃，連續(xù)6周，另一組不予任何處理即空白對照組(blank group)。處理后進(jìn)行雌雄合籠，雌鼠受孕后即分籠飼養(yǎng)。采用二氧化碳窒息處死新生小鼠，快速分離心臟組織。

2 主要試劑

抗caspase-3 抗體購自CST;抗active caspase-3抗體購自Arigo;抗Bcl-2抗體購自Santa Cruz; ChIP級抗乙?；M蛋白H3K9抗體和抗乙?；M蛋白H3K27抗體購自Abcam；抗β-actin鼠單克隆抗體、山羊抗兔及山羊抗小鼠帶HRP標(biāo)記的IgG抗體購自北京義翹神州生物技術(shù)有限公司；TUNEL試劑盒和全蛋白提取試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；BCA蛋白測定試劑盒購自Pierce；總RNA提取試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa；2×SYBR Green Mix試劑購自天根生化技術(shù)有限公司；ChIP試劑盒購自Abcam。

3 主要方法

3.1 TUNEL檢測心肌細(xì)胞凋亡 收集新生小鼠心臟組織每組3～5個，4%多聚甲醛處理24 h，30%蔗糖脫水處理48 h后，用OCT包埋，梯度降溫(-20 ℃，30 min)后-80 ℃保存。用冰凍切片機(jī)切成8 μm厚度薄片，制成組織切片，4 ℃保存。按照TUNEL試劑盒說明書步驟染色組織切片，熒光顯微鏡觀察，細(xì)胞核被DAPI標(biāo)記為藍(lán)色熒光，TUNEL陽性細(xì)胞被標(biāo)記為綠色熒光。

3.2 透射電鏡觀察心肌超微結(jié)構(gòu) 收集新鮮新生小鼠左心室心肌組織每組各3～5個，快速分離約1 cm×1 cm×1 cm大小組織碎塊，立刻放置于2.5%戊二醛固定液中保存，透射電鏡觀察心肌超微結(jié)構(gòu)由重慶醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)院電鏡中心完成。

3.3 qPCR實驗 收集新生小鼠心臟組織每組6～8個后按照總RNA提取試劑盒說明書步驟提取組織RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟得到cDNA進(jìn)而以之為模版進(jìn)行qPCR檢測。由上海生工生物工程有限公司設(shè)計并合成caspase-3、Bcl-2和內(nèi)參照β-actin引物序列，詳見表1。采用qPCR反應(yīng)10 μL體系，并設(shè)置3復(fù)孔，在QuantStudio?3 Real-Time PCR Instrument中進(jìn)行基因擴(kuò)增。條件為：95 ℃ 2 min;變性95 ℃ 10 s，退火68 ℃ 15 s，延伸60 ℃ 1 min，40次循環(huán)。熔解曲線程序：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。結(jié)果分析以β-actin為內(nèi)參照，通過2-ΔΔCt法計算caspase-3和Bcl-2的相對表達(dá)水平。

3.4 總蛋白提取及Western blot實驗 獲得新生小鼠心臟標(biāo)本每組5～6個后，按照凱基總蛋白提取試劑盒說明書步驟提取心肌組織全蛋白，通過BCA蛋白濃度測定后調(diào)整上樣量為每孔45 μg，在10%的SDS-PAGE進(jìn)行分離(80 V 30 min，100 V 1 h)，通過電轉(zhuǎn)(105 V，2 h)至0.22 μm的PVDF膜(經(jīng)甲醇激活15 s)，用5%脫脂奶粉封閉1 h，用5%BSA液稀釋(按說明書工作濃度)的Ⅰ抗工作液4 ℃孵育過夜，洗膜后室溫下孵育Ⅱ抗(110 000稀釋)2 h后洗膜，用ECL發(fā)光試劑盒顯影檢測蛋白。

3.5 ChIP-qPCR實驗 收集新生小鼠心肌組織每組3～5個，按照ChIP試劑盒說明書步驟進(jìn)行操作，簡要來說，首先利用甲醛進(jìn)行DNA-蛋白交聯(lián)實驗；第2進(jìn)行超聲DNA切割，切割DNA片段以200～500 bp為宜；第3經(jīng)利用前述ChIP級抗體進(jìn)行逆交聯(lián)，最后純化獲取與目的抗體結(jié)合的DNA。將DNA進(jìn)行qPCR實驗，操作同前描述。Caspase-3及Bcl-2基因啟動子區(qū)域引物序列見表1。

表1 引物序列

4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較應(yīng)用單因素方差分析(one-way ANOVA)，各組間均數(shù)的兩兩比較應(yīng)用SNK-q檢驗。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 新生小鼠出生體重檢測

子代新生小鼠生后進(jìn)行體重檢測。Alcohol組小鼠出生體重較對照組顯著降低(P<0.05)，見表2。

表2 新生小鼠出生體重

*P<0.05vsother groups.

2 小鼠心肌超微結(jié)構(gòu)

與對照組心肌超微結(jié)構(gòu)對比，酒精暴露組子代新生小鼠心肌肌原纖維含量明顯減少，肌絲部分?jǐn)嗔雅で?、排列紊亂，局部肌絲溶解，肌節(jié)結(jié)構(gòu)不完整、長短不一，且明暗帶不明顯，肌漿網(wǎng)擴(kuò)張，線粒體腫脹，其內(nèi)有糖原沉積，見圖1。

Figure 1. Cardiac ultrastructure evaluation (×10 000). A, B and C: alcohol exposure group; D: control group. Red arrows indicate disorder of sarcomere arrangement (A), enlargements of sarcoplasmic reticulum (B) and sarcomere dissolution (C). The scale bar=2 μm.

圖1 心肌超微結(jié)構(gòu)

3 小鼠心肌細(xì)胞凋亡水平檢測

TUNEL染色結(jié)果顯示，與對照組相比，酒精組子代小鼠心臟組織中凋亡的心肌細(xì)胞數(shù)量明顯增多，見圖2。

Figure 2. Myocardial apoptosis in various groups. Blue for DAPI and green for TUNEL positive cells. The scale bar=100 μm.

圖2 心肌細(xì)胞凋亡檢測

4 Caspase-3及Bcl-2 mRNA水平檢測

與對照組相比，酒精暴露組小鼠心肌組織中caspase-3 mRNA水平顯著升高(P<0.05)，而Bcl-2的mRNA水平較對照組顯著降低(P<0.05)，見圖3。

5 Active caspase-3和Bcl-2蛋白水平檢測

Western blot結(jié)果顯示與對照組和空白組相比，酒精暴露組Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低，而active caspase-3蛋白在酒精暴露組表達(dá)水平較對照組顯著升高(P<0.05)，見圖4。

Figure 3. Relative mRNA levels of caspase-3 and Bcl-2. Mean±SD.n=5.*P<0.05vsother groups.

圖3 Caspase-3及Bcl-2的mRNA表達(dá)水平

Figure 4. The protein levels of active caspase-3 and Bcl-2 were detected by Western blot. Mean±SD.n=5.*P<0.05vsother groups.

圖4 Active caspase-3及Bcl-2蛋白表達(dá)水平

6 Caspase-3及Bcl-2基因啟動子區(qū)域組蛋白H3K9及H3K27乙?；綑z測

利用ChIP-qPCR方法分別檢測caspase-3及Bcl-2基因啟動子區(qū)域組蛋白H3K9及H3K27乙?；?，酒精暴露組caspase-3啟動子區(qū)域組蛋白H3K9乙?；?acH3K9)水平較對照組與空白組顯著升高(P<0.05)，而H3K27乙?；?acH3K27)水平在各組間無顯著差異；酒精暴露組Bcl-2啟動子區(qū)域組蛋白H3K27乙?；捷^對照組與空白組顯著降低(P<0.05)，而H3K9乙?；皆诟鹘M間無顯著差異,見圖5。

Figure 5. The acH3K9 and acH3K27 levels on the promoters of caspase-3 and Bcl-2. A: acH3K9 levels on the promoter of caspase-3; B: acH3K27 levels on the promoter of caspase-3; C: acH3K27 levels on the promoter of Bcl-2; D: acH3K9 levels on the promoter of Bcl-2. Mean±SD.n=5.*P<0.05vsother groups.

圖5 Caspase-3及Bcl-2基因啟動子區(qū)域組蛋白H3K9及H3K27的乙?；?/p>

討 論

酒精對胚胎心臟發(fā)育影響的研究主要集中于母代孕期酒精暴露，即我們熟知的胎兒酒精綜合征(fetal alcohol syndrome, FAS)，該綜合征中先天性心臟病發(fā)生概率可達(dá)50%[4]。我們課題組先前利用動物模型亦觀察到，組蛋白修飾在孕期酒精暴露致胚胎心臟發(fā)育異常中發(fā)揮關(guān)鍵作用[5]。然而，近年流行病學(xué)研究顯示，父代飲酒亦可增加子代FAS發(fā)生率，同時可伴有子代的生長發(fā)育遲滯[6-8]。我們的研究同樣觀察到子代小鼠出生體重顯著下降。既往研究多集中于心臟大體形態(tài)觀察，直接發(fā)生如室間隔缺損和房間隔缺損概率并不高[8-9]，我們實驗中也并未觀察到心臟大體形態(tài)的顯著變化(數(shù)據(jù)未顯示)。本研究中，我們首次對父代飲酒的子代小鼠心臟超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行了觀察，顯示心肌組織中存在較廣泛的超微結(jié)構(gòu)破壞，包括肌絲排列紊亂、肌漿網(wǎng)擴(kuò)張及肌絲溶解等，進(jìn)一步的數(shù)據(jù)顯示父代飲酒引起子代心肌細(xì)胞凋亡水平明顯上升，即提示父代的酒精暴露可促進(jìn)子代心肌細(xì)胞凋亡，同母代孕期酒精暴露一致，均是心臟發(fā)育過程中的危險因素。

Caspase-3是經(jīng)典促凋亡蛋白，其活性形式active caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶[8], Bcl-2可以抑制由多種細(xì)胞毒因素所引起的細(xì)胞死亡[10-11], caspase-3及Bcl-2在凋亡中相互拮抗，共同參與調(diào)控細(xì)胞凋亡。因此，我們分別檢測了caspase-3及Bcl-2表達(dá)水平，數(shù)據(jù)提示，父代飲酒的子代模型動物中caspase-3及Bcl-2在轉(zhuǎn)錄水平均發(fā)生變化，表現(xiàn)為caspase-3升高，而Bcl-2表達(dá)降低。在蛋白層面，基于具有活性成份的active caspase-3顯著升高，表明caspase-3的活化水平增加，促進(jìn)凋亡的發(fā)生；而抑制凋亡的重要蛋白Bcl-2含量降低，對于凋亡的抑制作用降低，從而導(dǎo)致心肌細(xì)胞內(nèi)失衡，表現(xiàn)為凋亡的發(fā)生。

有研究發(fā)現(xiàn)組蛋白修飾對凋亡基因具有調(diào)控作用，是基因轉(zhuǎn)錄過程中的關(guān)鍵調(diào)控因子，有利于轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，而組蛋白去乙?；饔脛t相反，抑制基因轉(zhuǎn)錄[12-13]。組蛋白H3具有諸多可以發(fā)生乙?；馁嚢彼嵛稽c，第9和27位賴氨酸是其中最為重要的2個乙?；稽c，組蛋白H3K9和H3K27的乙?；潜姸嗷蚧罨?、轉(zhuǎn)錄的重要調(diào)控因素[14-15]。我們的數(shù)據(jù)顯示父代飲酒的子代小鼠心肌組織中caspase-3啟動子區(qū)域組蛋白H3K9乙酰化水平升高；另一方面，Bcl-2啟動子區(qū)域組蛋白H3K27乙酰化水平顯著降低，這與caspase-3轉(zhuǎn)錄水平的升高和Bcl-2轉(zhuǎn)錄水平的下降結(jié)果一致。這提示組蛋白乙酰化可能通過不同賴氨酸位點的修飾，實現(xiàn)對促凋亡基因及抑凋亡基因轉(zhuǎn)錄的動態(tài)調(diào)控，父代酒精暴露可改變子代小鼠心肌組織凋亡基因組蛋白乙?；钠胶?，進(jìn)而導(dǎo)致促凋亡和抑凋亡蛋白表達(dá)的失調(diào)。

綜上所述，本研究提示父代飲酒對子代心臟發(fā)育造成諸多不良影響，主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞的凋亡發(fā)生，而父代的酒精暴露是通過影響caspase-3及Bcl-2啟動子區(qū)域組蛋白乙酰化修飾水平來參與子代新生小鼠心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生。據(jù)我們所知，這是首次對父代酒精暴露后子代心肌細(xì)胞程凋亡過程中組蛋白修飾的研究。然而這些新生小鼠成年后會有何種心臟疾病表型？組蛋白乙酰化又是通過哪些乙?；负?或)去乙?；刚{(diào)控凋亡發(fā)生？這些問題仍需進(jìn)一步實驗研究。