烏 素，楊曉艷，班 瑞，李少英

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018）

乳酸菌是一類可以發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生乳酸的細(xì)菌統(tǒng)稱[1]，是日常生活中最常見、應(yīng)用最廣泛的一類菌，目前乳酸菌分為43個(gè)屬，共有373個(gè)種和亞種[2]。嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus） 和保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）作為最經(jīng)典的酸奶發(fā)酵劑菌種，二者常一起用于酸奶生產(chǎn)，通過共生作用相互促進(jìn)，大大提高生長速度并改善了酸奶的品質(zhì)[3-5]。而植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）可以有效預(yù)防冠心病和動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病[6]，嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌和植物乳桿菌三者以1∶1∶1的比例搭配發(fā)酵乳類不會(huì)產(chǎn)生拮抗作用[7]。乳酸菌的益處漸漸被人們所認(rèn)識(shí)，再加上人類健康意識(shí)的不斷提高，乳酸菌的利用程度也大大提高[8]。但不是每個(gè)生長階段的乳酸菌涂片都展現(xiàn)乳酸菌典型的形態(tài)，乳酸菌是革蘭氏陽性菌[9]，可以根據(jù)其生長曲線培養(yǎng)不同生長時(shí)間段的菌群進(jìn)行革蘭氏染色、涂片觀察，以便更好地觀察和認(rèn)識(shí)乳酸菌的典型形態(tài)。革蘭氏染色法有助于區(qū)分革蘭氏陽性（G+）菌和革蘭氏陰性（G-）菌，大多數(shù)革蘭氏陽性菌以所產(chǎn)的外毒素致病，而大多數(shù)革蘭氏陰性菌則以所產(chǎn)的內(nèi)毒素致病，可根據(jù)感染菌株的革蘭氏染色結(jié)果對(duì)相應(yīng)致病菌菌型及其所產(chǎn)毒素進(jìn)行判斷和及時(shí)治療[10-11]。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)用菌

試驗(yàn)組:實(shí)驗(yàn)室早期保藏的保加利亞乳酸桿菌Lactobacillus bulgaricus CICC:6064，購于中國微生物菌種保藏管理中心，以下簡稱為Lb1；保藏的嗜熱鏈球菌Streptococcus thermophilus 6063，購于中國微生物菌種保藏管理中心，以下簡稱為St1；保藏的植物乳桿菌Lactobacillus plantarum CICC:6238，購于中國微生物菌種保藏管理中心，以下簡稱為Zb1。

對(duì)照組:購買的保加利亞乳酸桿菌Lactobacillus bulgaricus G DMCC1.155，購于廣東省食品微生物安全工程技術(shù)研究開發(fā)中心，以下簡稱為Lb2，St1和Zb1。

1.1.2 主要試劑

M RS肉湯培養(yǎng)基（生化試劑），青島海博生物技術(shù)有限公司提供；瓊脂（生化試劑），天津市英博生化試劑有限公司提供；氯化鈉（分析純），天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司提供；革蘭氏染色液，南京建成生物工程研究所提供。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備

K DC-140HR型高速冷凍離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；C P522C型電子天平，奧豪斯儀器（上海）有限公司產(chǎn)品；W PL-230BE型電熱恒溫培養(yǎng)箱、BBS-S DC型潔凈工作臺(tái)，天津市泰斯特儀器有限公司產(chǎn)品；GR60D A型立式自動(dòng)壓力蒸汽滅菌器，致微（廈門） 儀器有限公司產(chǎn)品；D M500+ICC50Leica型顯微鏡，德國徠卡儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 菌種的活化培養(yǎng)

無菌環(huán)境下，取3種菌株的菌種各1支，分別接種到3支滅菌M RS液體培養(yǎng)基中，混勻后在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h進(jìn)行菌種的活化，此為第一代菌。重復(fù)上述操作，活化為二代菌[12]。將第二代菌接種至新的M RS液體培養(yǎng)基中，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng) 8，10，12，14，16，18，20，22，24 h，并進(jìn)行涂片。

1.2.2 革蘭氏染色

將已經(jīng)涂好的細(xì)菌涂片在酒精燈外焰上固定3次。在涂片上滴加適量草酸銨結(jié)晶紫染液，初染1 min，水洗，自然干燥；滴加適量碘液，媒染1 min，水洗，自然干燥；滴加適量95%乙醇，脫色30 s，水洗，自然干燥[8，13]；滴加適量番紅染液，復(fù)染1 min，水洗，自然干燥。在油鏡（100×）下鏡檢，細(xì)菌涂片呈現(xiàn)紫色為革蘭氏陽性菌，呈現(xiàn)紅色為革蘭氏陰性菌[12]。蓋上蓋玻片，用中性樹脂粘合邊緣，保存涂片以備后續(xù)觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)時(shí)間三株菌的形態(tài)特征

將3種菌的第二代菌分別接種至新的M RS液體培養(yǎng)基中，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)8，10，12，14，16，18，20，22，24 h。

Lb1，St1，Zb1培養(yǎng) 8～24 h 的形態(tài)特征見表 1，Lb2，St1，Zb1培養(yǎng) 8～24 h的形態(tài)特征見表 2。

由表1可以看出，保加利亞乳桿菌（Lb1）培養(yǎng)10～16 h，20～24 h時(shí)形態(tài)特征表現(xiàn)明顯且穩(wěn)定，均為鏈狀，培養(yǎng)8 h呈雙球狀、培養(yǎng)18 h呈短桿狀，可能是由于此時(shí)間段的涂片拍攝到的是菌體正處于分裂階段，形態(tài)特征與其他時(shí)間段稍有不同，在培養(yǎng)24 h整個(gè)過程中，整體形態(tài)特征比較穩(wěn)定，可以看出菌體一直處于快速生長分裂過程中。嗜熱鏈球菌（St1）整個(gè)培養(yǎng)過程中形態(tài)特征表現(xiàn)明顯且穩(wěn)定，其中培養(yǎng)8～16 h時(shí)為雙球狀，18～24 h為鏈球狀，由此推測(cè)嗜熱鏈球菌在培養(yǎng)8～16 h為對(duì)數(shù)生長期，培養(yǎng)20～24 h進(jìn)入穩(wěn)定期。植物乳桿菌（Zb1）整個(gè)培養(yǎng)過程中形態(tài)特征表現(xiàn)明顯且穩(wěn)定，其中培養(yǎng)8～20 h時(shí)為雙球狀，22～24 h為短棒狀，由此推測(cè)植物乳桿菌在培養(yǎng)8～20 h為對(duì)數(shù)生長期，培養(yǎng)22～24 h進(jìn)入穩(wěn)定期。

表1 L b1，S t1，Zb1培養(yǎng)8～24 h的形態(tài)特征

表2 L b2，S t1，Zb1培養(yǎng)8～24 h的形態(tài)特征

由表2可以看出，保加利亞乳桿菌（Lb2）培養(yǎng)24 h形態(tài)特征表現(xiàn)明顯且穩(wěn)定，均為長桿狀，由此推測(cè)保加利亞乳桿菌已經(jīng)進(jìn)入穩(wěn)定期，呈現(xiàn)菌體的典型形態(tài)特征。植物乳桿菌（Zb1）培養(yǎng)18 h之后形狀和18 h之前幾個(gè)時(shí)間段菌的形狀不同，出現(xiàn)了短棒狀，因此推測(cè)植物乳桿菌在形狀發(fā)生變異之后，可以通過復(fù)壯方法實(shí)現(xiàn)菌形態(tài)的恢復(fù)。

由表1和表2可以看出，用于革蘭氏染色試驗(yàn)的保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、植物乳桿菌菌齡以16～18 h為宜。這是因?yàn)榧?xì)菌在一般適宜的培養(yǎng)條件下，十幾個(gè)小時(shí)即進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期。若培養(yǎng)時(shí)間過長，細(xì)菌進(jìn)入穩(wěn)定期或衰亡期，隨著衰退型或死亡菌體的大量出現(xiàn)及菌體的自溶，其細(xì)胞壁失去了保留結(jié)晶紫的能力，就可能會(huì)表現(xiàn)出陰性反應(yīng)，且菌齡過長，菌體會(huì)出現(xiàn)異常形態(tài)，著色力會(huì)大為減弱[14]。

2.2 不同染色時(shí)間對(duì)涂片效果的影響

不同染色時(shí)間對(duì)涂片效果的影響見表3，A組染色時(shí)間3株菌的形態(tài)特征見圖1，B組染色時(shí)間3株菌的形態(tài)特征見圖2，C組染色時(shí)間保加利亞乳桿菌的形態(tài)特征見圖3。

表3 不同染色時(shí)間對(duì)涂片效果的影響

圖1 A組染色時(shí)間3株菌的形態(tài)特征

圖2 B組染色時(shí)間3株菌的形態(tài)特征

圖3 C組染色時(shí)間保加利亞乳桿菌的形態(tài)特征

由圖1可以看出，將酒精脫色時(shí)間延長至50 s時(shí)，A組3株菌的細(xì)胞顏色較淺，且一部分細(xì)胞邊緣模糊。因此推測(cè)可能是酒精脫色時(shí)間太長，導(dǎo)致細(xì)胞壁部分被破壞。由圖2可以看出，將初染、媒染、復(fù)染的時(shí)間增加到3 min時(shí)，B組圖片中菌的顏色明顯，呈現(xiàn)偏藍(lán)色且不均勻。由圖3可以看出，番紅著色能力較弱，菌片呈現(xiàn)淡粉色，因此推測(cè)圖2中出現(xiàn)大面積藍(lán)色，可能是番紅沒有草酸銨結(jié)晶紫染液的著色能力強(qiáng)。

3 結(jié)論

同一組試驗(yàn)當(dāng)中，每隔2 h同一菌株的形態(tài)基本沒有發(fā)生改變，因此推測(cè)每2 h剛好是乳酸菌同一生長期。3株乳酸菌在培養(yǎng)16～18 h時(shí)，為對(duì)數(shù)期末期，革蘭氏染色試驗(yàn)菌體呈現(xiàn)典型形態(tài)。植物乳桿菌和保加利亞乳桿菌的形態(tài)不是典型的桿狀，可以作為特殊形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)涂片供觀察學(xué)習(xí)。在形狀發(fā)生變異之后，可以通過復(fù)壯方法實(shí)現(xiàn)菌形態(tài)的恢復(fù)。在對(duì)菌體染色過程中，應(yīng)注意控制好菌齡和脫色時(shí)間[15-17]，才能得到正確的染色結(jié)果。