羅翠婷 顏舒柳 張一帆

基金項目：廣東省農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化專項資金資助的項目（粵財農(nóng)[2012]528號）。

作者簡介：羅翠婷（1986- ）， 女， 漢族，碩士， 講師，研究方向為藥學(xué)教學(xué)。E-mail：t3929546@163.com

通信作者：

【摘 要】 目的：建立靈芝及其相關(guān)產(chǎn)品中麥角甾醇物質(zhì)含量的測定方法。方法：采用高效液相色譜（HPLC）方法定量分析靈芝及其相關(guān)產(chǎn)品中麥角甾醇物質(zhì)的含量。色譜柱為Agilent prep-C18 （250mm×4.6mm，5μm ），流動相：98%色譜甲醇，流速：1.0mL/min，檢測波長：282nm，柱溫：28 ℃。結(jié)果：麥角甾醇在20～200μg/mL呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為：y=13.32x-24.32（r=0.999 7），平均加樣回收率為98.50%～99.93%，RSD為0.5%。結(jié)論：本法操作簡單、結(jié)果準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，為靈芝及其相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供參考方法。

【關(guān)鍵詞】 靈芝;麥角甾醇;HPLC

【中圖分類號】R284.1 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號】1007-8517（2019）7-0039-03

Abstract：Objective To establish a method for determination of ergosterol in? Ganoderma lucidum and its related products. Methods the content of ergosterol in Ganoderma lucidum and its related products was used to quantitatively analyze by High performance liquid chromatography （HPLC）. The separation was performed on an Agilent prep-C18 column，with 98% Chromatographic methanol as the mobile phase at a flow rate of 1.0mL/min. The Detection wavelength was 282nm; the column temperature was 28℃. Results Ergosterol showed a good linear relationship within the range of 20～200μg/mL. The linear regression equation is ：y=13.32x-24.32（r=0.9997）.The average sample recovery rate is 98.50%-99.93%， and RSD is 0.5%. Conclusions The method is simple、accurate and credible，that can provide a reference method for the quality control of Ganoderma Lucidum and its related products.

Keywords：Ganoderma Lucidum; Ergosterol; HPLC

靈芝為多孔菌科真菌赤芝Gauoderma Lucidum（Leyss. ex Fr.）Karst.或紫芝Gauoderma sinense Zhao Xu et Zhang的干燥子實體，具有補(bǔ)氣安神、止咳平喘之功效[1]。靈芝是傳統(tǒng)的名貴滋補(bǔ)中藥，也是常見的保健食品，具有很高的經(jīng)濟(jì)價值。隨著生活水平的提高，越來越多的消費者喜愛購買靈芝及其相關(guān)產(chǎn)品保健養(yǎng)生，尤其腫瘤病患者，更是樂于購買這些產(chǎn)品作輔助治療。靈芝及其相關(guān)產(chǎn)品產(chǎn)量雖大但監(jiān)管依據(jù)未健全，若沒有有效的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，靈芝及其加工品很難從外表判斷其質(zhì)的優(yōu)劣，若不法商家以次充好，輕則給消費者造成經(jīng)濟(jì)損失，重則加重了原有的病情而危及人身安全，因此建立靈芝及其相關(guān)產(chǎn)品有效的質(zhì)量控制方法是非常有必要的[2]。

目前行業(yè)內(nèi)公認(rèn)的傳統(tǒng)功校驗證指標(biāo)尚顯粗放，缺乏對靈芝及其相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量控制方法。因麥角甾醇類是菌類植物中特有成分，具有調(diào)節(jié)新陳代謝、調(diào)節(jié)激素水平、預(yù)防心血管疾病等功能，且在靈芝及其相關(guān)產(chǎn)品中含量較高，可作為評價靈芝及其相關(guān)產(chǎn)品質(zhì)量的有力質(zhì)量控制指標(biāo)。故本研究建立了HPLC測定靈芝及其產(chǎn)品中麥角甾醇含量的方法，以期為靈芝及其產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供有效方法和檢驗依據(jù)[3-4]。

1 儀器與材料

1.1 儀器 安捷倫高效液相色譜;電子天平;水浴鍋;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀;循環(huán)水式真空泵;超聲波清洗器。

1.2 材料 色譜純甲醇;去離子純凈水;95%乙醇;分析純石油醚。

麥角甾醇對照品購于中國藥品生物制品檢定所;靈芝及其相關(guān)產(chǎn)品均由廣東粵微食用菌技術(shù)有限公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[4-5] 色譜柱：Agilent prep-C18 （250 mm×4.6 mm，5 μm ）;流動相：98%純甲醇;檢測波長：282nm;流速：1.0mL/min;柱溫：28 ℃;進(jìn)樣量：20μL;外標(biāo)法測定。

2.2 對照品溶液的制備 麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)工作液：精密稱定麥角甾醇對照品10mg，置50mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻超聲，即得（每1 mL中含麥角甾醇0.2000mg）。

2.3 供試品溶液的制備[6] 靈芝提取物溶液：取本品1.0g（n=3），精密稱定，置錐形瓶中，精密加入25mL甲醇溶解，超聲處理60 min，取出，放冷，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，過濾，取濾液過0.45μm微孔濾膜，置4 ℃冰箱保存。孢子油溶液：取靈芝袍子油0.5g（n=3），精密稱定，置10mL量瓶中，加無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻即得，過0.45μm微孔濾膜，置4℃冰箱保存。

靈芝菌絲體/靈芝子實體/靈芝孢子粉/全靈芝孢子粉溶液：精密稱取樣品1.0 g（n=3），加95%乙醇50mL，恒溫85℃水浴，回流1h，過濾，于殘渣中分別按上面方法提取3次，合并濾液，減壓濃縮，用甲醇定容至10mL，搖勻，0.45μm濾膜過濾，置4℃冰箱保存。

2.4 供試品溶液制備方法的優(yōu)選[7-8]

2.4.1 提取方法的選擇 取干燥靈芝子實體1g，用95%乙醇浸泡過夜，濾出上清液;殘渣中加95%乙醇后超聲30 min或85℃回流1 h，過濾合并濾液，濃縮，定容至10 mL，過0.45 μm濾膜，進(jìn)樣分析。實驗結(jié)果表明，采用回流提取方法測得的麥角甾醇含量高于超聲提取方法，故本實驗采用回流提取。見表1。

2.4.2 提取溶劑的選擇 取干燥靈芝子實體1 g，分別用甲醇、95%乙醇、石油醚等不同溶劑，以上述回流方式處理，結(jié)果表明采用甲醇為提取溶劑的麥角甾醇提取量最高，乙醇提取略次之，考慮到用乙醇的毒性及成本均低于甲醇，故選擇乙醇為提取溶劑。見表2。

提取溶劑子實體麥角甾醇含量/mg/g

甲醇2.19

2.4.3 正交實驗比較回流所用的料液比、提取次數(shù)及提取時間的組合選擇 選取料液比、提取次數(shù)及提取時間作為考察因素，分別記為因素A、因素B和因素C，作三因素三水平正交試驗。取干燥靈芝子實體1 g，用95%乙醇浸泡過夜，濾出上清液;殘渣中加95%乙醇后按正交設(shè)計的方法在85℃進(jìn)行回流，過濾合并濾液，濃縮，定容至10mL，過0.45μm濾膜，進(jìn)樣分析。見表3、表4和表5。

討論：使用軟件“正交設(shè)計助手”對正交數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果表明各因素對綜合評分的影響都無顯著性意義。極差分析表明，因素A（料液比）為主要影響因素，其次是提取次數(shù)因素，各因素作用主次順序為A>B>C，通過綜合考慮確定，最佳方法為A3B3C1，即料液比為1∶[KG-*3/5]50，提取3次，每次回流1h。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍[9-10] 分別精密吸取對照品貯備液溶液10， 8， 4， 2，1mL置于10mL容量瓶中。加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制得不同濃度對照品溶液。過0.45μm微孔濾膜后分別吸取20μL標(biāo)品溶液注入液相色譜儀。以峰面積（x）為橫坐標(biāo)，對照品麥角甾醇的進(jìn)樣量（y）為縱坐標(biāo)，得線性回歸方程。線性回歸方程為：y=13.32x-24.32 ，r=0.9997，結(jié)果表明麥角甾醇在20-200μg/mL呈良好的線性關(guān)系。定量限設(shè)定為20g/mL，最低檢出限視所用儀器信噪比而定，一般為信噪比的2～10倍，本標(biāo)準(zhǔn)檢測限位0.2g/mL，與目前國內(nèi)文獻(xiàn)檢測限相比，具有一定優(yōu)勢。色譜圖如圖1所示。

2.6 樣品含量測定 按2. 3項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進(jìn)行含量測定，根據(jù)樣品測定的色譜峰面積，以外標(biāo)法計算樣品中麥角甾醇的含量，計算公式：X= C×V/（M×1 000），式中： X為試樣中游離麥角甾醇的含量（mg/g）;C為游離麥角甾醇的質(zhì)量濃度（g/ mL）; V為試樣定容體積（mL）; M為試樣的質(zhì)量（g）。測定結(jié)果見表6。

2.7 方法性能指標(biāo)考察[11]

2.7.1 精密度試驗 精密吸取麥角甾醇對照品浴液（0.2 000mg/mL） 20μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，分別測定其峰面積值，計算峰面積積分值RSD為0.5%， 表明該儀器精密度良好。

2.7.2 重復(fù)性試驗 精密稱量樣品6份，按1.3項方法制備，進(jìn)樣20μL，測定其峰面積值，計算峰面積積分值的RSD為1.2%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7.3 穩(wěn)定性試驗 將樣品溶液在室溫下貯存，每間隔0、2、4、8、12、24h各進(jìn)樣20μL，測定其峰面積，RSD為1.08%，說明樣品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7.4 加樣回收率試驗 精密稱取己知含量的供試品，分別加入麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)品1.90mg、2.40mg、2.80mg，按照上述樣品的制備和分析步驟測定其峰面積值，計算回收率。見表7。

由表7可知，麥角固醇的回收率在98.50%～99.93%之間，表明回收良好，此方法穩(wěn)定可靠，適宜于靈芝及其相關(guān)產(chǎn)品中麥角固醇含量的測定。

3 結(jié)論

本研究建立的HPLC 測定麥角甾醇含量的方法，能準(zhǔn)確地測定靈芝及其相關(guān)產(chǎn)品中該成分的含量。經(jīng)過精密度實驗、重復(fù)性實驗、穩(wěn)定性實驗、回收率實驗驗證，該方法均符合測定要求。該方法操作簡便，穩(wěn)定性好，重現(xiàn)性高，特異性強(qiáng)，可作為靈芝及其產(chǎn)品中麥角甾醇的有效測定方法和質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，對于其他真菌的麥角甾醇含量測定與質(zhì)量評價方法的建立也有參考價值和依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1]張麗，王瑜杰，丁安偉. HPLC法測定靈芝抱子油中麥角甾醇的含量[J].江蘇中醫(yī)藥， 2009， 41（ 6） ： 52-53.

[2]陳路林，李吉來，寧德山，等. 靈芝孢子油麥角甾醇含量測定方法研究[J].中藥材， 2008， 31（ 12） ：1843-1845.

[3]張燕. 赤芝中麥角甾醇酯的色譜分離和檢測方法研究[D].廣州： 中山大學(xué)， 2009： 5.

[4]劉京晶，黃文華，呂明亮. HPLC法測定不同品種及段木栽培靈芝子實體中麥角甾醇含量[J].中藥材， 2011， 34（ 2） ： 187-190.

[5]孫金旭，魏連秋，朱會霞. 靈芝深層發(fā)酵中麥角苗醇含量的測定[J].現(xiàn)代食品科技， 2013， 29（ 9） ：2267-2270.

[6]尹輝. 靈芝化學(xué)成分研究概述[J]. 山東農(nóng)業(yè)工程學(xué)院學(xué)報， 2017， 34（2） ： 152-153.

[7]王金艷，馮娜，劉艷芳，等. 靈芝孢子粉中麥角甾醇的測定分析及其脂溶性成分指紋圖譜[J]. 菌物學(xué)報， 2018， 37（9）： 1215-1223.

[8]王涵，于江洪，李愛欣，等. HPLC法測定松杉靈芝發(fā)酵產(chǎn)物中甘露醇和麥角甾醇[J]. 實驗技術(shù)， 2016， 38（6）： 66-67.

[9]來李娟，鄧祖磊，崔田，等. HPLC法測定猴頭菌片中麥角甾醇的含量[J]. 海峽藥學(xué)， 2018，30（2）：71-72.

[10]王麗瑩，胡德，湯磊，等. HPLC 雙波長法同時測定樺褐孔菌子實體中麥角甾醇和麥角甾酮的含量[J]. 藥學(xué)研究，2017， 36（9）：509-511.

[11]姜濤，施枝江，姚藝新，等. 不同品種靈芝多指標(biāo)的質(zhì)量評價研究[J].中藥材，2018， 41（12）：2595-2599.

（收稿日期：2019-01-31 編輯：陶希睿）