李汪洋 劉鑫 李國明 全若琳 楊海嬌 李貴 魏華 張曉蓉

摘 要 通過超聲波輔助提取冬青葉總黃酮，構(gòu)建了鋁鹽雙波長比色法檢測總黃酮模型，優(yōu)化了冬青葉總黃酮的測定方法，其測定波長為510 nm，參比波長為450 nm，在0.00～39.29 μg·mL-1時可用于測定冬青總黃酮，擬合的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.017X-0.000 8，R2=0.999 3。通過該方法測定冬青葉中總黃酮的含量為2.21%～2.55%（n=6）。鋁鹽雙波長比色法可用于快捷簡便地測定冬青葉中的總黃酮含量。

關(guān)鍵詞 冬青;總黃酮;含量測定;鋁鹽雙波長比色法

中圖分類號：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2019.06.067

冬青（Ilex chinensis Sims）為冬青科Aquifoliaceae冬青屬Ilex多年生植物，我國主產(chǎn)于安徽省、江西省、浙江省、兩湖兩廣等江南各省，一般生長于海拔500～1 000 m

的山坡常綠闊葉林中和林緣地帶。冬青屬植物多用于清熱解毒、消炎、鎮(zhèn)咳祛痰及治療心血管疾病。冬青的根、種子、樹皮均可入藥，其葉有清熱利濕、消腫鎮(zhèn)痛之功效，用于肺炎、急性咽喉炎癥、痢疾、膽道感染、外治燒傷、下肢潰瘍、皮炎濕疹、腳手皮裂等[1-3]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，黃酮類是冬青主要活性成分之一，其具有明顯的降壓降脂、抗菌消炎及抗腫瘤等藥理功能。在對冬青葉中總黃酮含量進(jìn)行測定時，發(fā)現(xiàn)其直接測定結(jié)果偏高;與文獻(xiàn)報道冬青葉總黃酮的含量存在較大差異（一般<3%）。基于此，擬采用雙波長等方法對冬青葉中總黃酮含量測定體系進(jìn)行研究，以優(yōu)化和改進(jìn)總黃酮含量測定體系。

1 材料與方法

實驗儀器主要有超純水制備系統(tǒng)（P20-Y，長沙源科儀），電子天平（1/100 000，AG285，METTLE TOLEDO），紫外可見分光光度儀（UV2550，島津），超聲波提取器（昆山市超聲提取有限公司），萬能高速粉碎機(jī)（天津市斯泰勒儀器有限公司）。實驗試劑包括蘆丁標(biāo)準(zhǔn)樣品（融禾公司生產(chǎn)）及以下為分析純試劑：乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉;實驗用水為超純水。實驗材料冬青葉于60 ℃恒溫干燥，粉碎，過70目篩，裝袋備用。

實驗方法主要參考劉亞倩等[4-6]研究者進(jìn)行蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備、冬青總黃酮供試品溶液的提取富集、總黃酮含量的檢測等步驟，并在此基礎(chǔ)上改進(jìn)冬青葉總黃酮檢測方法。具體步驟如下。

1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

準(zhǔn)確移取0 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、4.0 mL、6.0 mL、8.0 mL、10.0 mL、15.0 mL的0.2 mg·mL-1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別置于50 mL比色管中，加1.50 mL5.0%亞硝酸鈉溶液，搖勻后靜置11 min，加入1.50 mL10.0%硝酸鋁溶液，搖勻，靜置12 min后加入10 mL4.0%氫氧化鈉溶液，搖勻，靜置20 min，于510 nm及參比波長450 nm處測定其吸光值，記錄下不同濃度吸光值。運(yùn)用Excel等軟件，以濃度為X軸，吸光值差值為Y軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=0.017X-0.000 8，Y吸光度，X為濃度，R2=0.999 3，在（0，39.29]μg·mL-1檢測范圍內(nèi)符合該方程

1.2 供試品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取0.250 g冬青樣品于50 mL容量瓶中，用60%乙醇20 mL超聲提取30 min后取出定容，過濾，濾液即為待測供試品溶液。

1.3 總黃酮含量測定

移取10 mL待測供試品溶液于50 mL比色管中，加入10 mL去離子水，搖勻，加入1.5 mL5%的亞硝酸鈉，搖勻，靜置11 min，加入1.5 mL10%硝酸鋁，搖勻，靜置12 min后再加入10 mL4%氫氧化鈉溶液，搖勻靜置20 min后在510 nm及參比波長處測定其吸光度，根據(jù)差值建立標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算總黃酮濃度然后進(jìn)一步計算總黃酮含量。計算公式：

式中，W為總黃酮含量（%），C為總黃酮濃度（μg·mL-1），V2為稀釋定容體積（mL），V1為取樣體積（mL），V0為提取液總體積（mL），M為供試樣品質(zhì)量（g），兩個1 000分別表示μg到mg及mg到g的換算系數(shù)，100則表示100 g樣品中總黃酮的含量。

1.4 改進(jìn)樣品測定方法

樣品測定方法包括供試樣品溶液的全波長掃描、篩選和建立雙波長檢測模型及驗證擬合檢測結(jié)果等。以下是操作步驟。1）供試樣品溶液的全波長掃描。分別吸取之前備好的供試品溶液在比色皿中，潤洗1～3次后加入比色皿中，利用紫外分光光度儀在檢測波長510 nm和參比波長450 nm處進(jìn)行測定并分別記錄下其吸光度。2）篩選和建立雙波長檢測模型。通過全波長掃描圖譜，分析其供試樣品的峰值及可能存在干擾的峰谷值，并通過△OD來篩選和建立雙波長檢測模型。其中，△OD=OD510 nm-OD450 nm，通過扣除干擾，從而對檢測項目進(jìn)行測定和計算。3）驗證擬合檢測結(jié)果。通過測定6份不同批次供試材料樣品，對擬合檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計，初步驗證和評價擬合模型的科學(xué)性程度。

2 結(jié)果與分析

經(jīng)過對各個供試樣品的全波長掃描結(jié)果進(jìn)行解析，發(fā)現(xiàn)其總黃酮掃描的峰值出現(xiàn)在（500±4）nm，而（450±4）nm處存在一峰谷值，與主峰OD500 nm的峰值存在明顯疊加。分析表明這種吸光值的疊加，極有可能是造成冬青總黃酮含量測定干擾的主因。經(jīng)過△OD（OD500 nm-OD450 nm）雙波長擬合扣除干擾后，測定6份冬青葉供試材料的總黃酮含量，其總黃酮的含量最低為2.24%，最高為2.60%，6份樣本的平均值為2.21%～2.55%。

在課題組預(yù)實驗時發(fā)現(xiàn)，通過鋁鹽單波長比色法測得冬青葉總黃酮含量高于文獻(xiàn)中報道（其總黃酮均低于3%）1倍以上，可能是冬青葉中的其他成分在總黃酮的檢測中，由吸光度疊加引起的。而通過△OD（OD500 nm-OD450 nm）雙波長擬合扣除干擾后，能夠較好地測定冬青葉中總黃酮的含量，初步表明該雙波長檢測方法適用于檢測冬青葉中的總黃酮含量[7]。

3 結(jié)語

冬青葉總黃酮測定中的雜質(zhì)消除、總黃酮中主要黃酮類物質(zhì)的提取工藝及高純度冬青葉中的黃酮類單體的制備也是后續(xù)研究工作的一部分。冬青葉中總黃酮測定的鋁鹽雙波長比色法，實現(xiàn)了冬青葉中總黃酮含量的科學(xué)、快捷檢測，為冬青葉中總黃酮資源的研究和開發(fā)提供了理論基礎(chǔ)和實踐參考。

參考文獻(xiàn)：

[1] 中國植物志編輯委員會.中國植物志[M].北京：科學(xué)出版社，1999.

[2] 俞祥生，王強(qiáng).冬青屬植物葉成分分析[J].中國藥科大學(xué)學(xué)報，1992，6（2）：26-28.

[3] 陳衛(wèi)琳，程再興，陳紅，等.正交設(shè)計優(yōu)選毛冬青總黃酮提取工藝[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2011，13（10）：62-63.

[4] 田建平，李娟玲，胡遠(yuǎn)艷，等.冬青屬苦丁茶葉總黃酮含量測定與資源評價[J].食品科技，2014，39（1）：278-281.

[5] 劉亞倩，魏華，李貴，等.薺菜總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定及超聲波提取工藝優(yōu)化[J].吉首大學(xué)學(xué)報，2016，37（1）：74-79.

[6] 張?zhí)m杰，辛廣，張維華.雙波長分光光度法測定黑玉米花粉中總黃酮的含量[J].食品科學(xué)，2006，27（2）：230-232.

[7] 劉謹(jǐn)，丁平.冬青屬藥用植物資源、化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2008，25（3）：277-280.

（責(zé)任編輯：劉昀）