苗玉迪 李艷春 李慶瑞

白血病是常見(jiàn)的血液系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其中急性髓細(xì)胞白血病(acute myelogenous leukemia,AML)是發(fā)生率最常見(jiàn)的白血病類型，約占所有白血病的60%[1，2]。目前針對(duì)AML的治療主要是應(yīng)用化療藥物與放射治療，促進(jìn)白血病患者緩解率增加、病死率降低，但是很多患者由于對(duì)化療藥的耐受，導(dǎo)致治療失敗[3，4]。難治性AML是用標(biāo)準(zhǔn)的誘導(dǎo)緩解方案治療2個(gè)療程未達(dá)完全緩解者，也包括多次復(fù)發(fā)者，這類患者對(duì)于放射線和化療藥物具有較強(qiáng)抵抗性，對(duì)于治療的要求更高[5]。

目前難治性AML的發(fā)病機(jī)制還不明確，被認(rèn)為是多種因素共同作用的結(jié)果[6]?，F(xiàn)代研究表明，多條信號(hào)通路交互作用是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的一個(gè)重要過(guò)程，可涉及多條信號(hào)通路的調(diào)控[7]。Hedgehog通路可參與血管生成、干細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育、器官成熟，其異常活化與多種腫瘤發(fā)生相關(guān)，包括前列腺癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、甲狀腺癌、膀胱癌等[8]。Hedgehog通路中的SHh、DHh、IHh 3個(gè)配體可與效應(yīng)細(xì)胞表面的Patched(PTCH)蛋白結(jié)合，促進(jìn)信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)并激活下游一系列因子的過(guò)程[9]。當(dāng)前研究表明Hedgehog通路可存在于骨髓基質(zhì)細(xì)胞，Sonic Hedgehog(SHH)信號(hào)通路可參與骨髓基質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化過(guò)程中，但是可被Hedgehog通路抑制劑Cyclopamine抑制[10]。生物信息學(xué)表明Hedgehog通路在難治性AML細(xì)胞中表達(dá)顯著高于非難治性急性白血病，可能在難治性AML治療反應(yīng)中具有重要作用[11]。本研究具體探討了Hedgehog通路介導(dǎo)難治性AML生物學(xué)功能的影響，以分析Hedgehog通路具有介導(dǎo)白血病細(xì)胞治療耐藥性與放射抵抗的作用機(jī)制?，F(xiàn)總結(jié)報(bào)道如下。

材料與方法

1.研究材料:人多藥耐藥的白血病HL60/ADR細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，放射抵抗的HL60/RX細(xì)胞株由購(gòu)自上海生化研究所。都在在37℃、5%CO2無(wú)菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)液為含10%的胎牛血清的DEMD。每2～3天進(jìn)行傳代或者換液培養(yǎng)，選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好、處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。Hedgehog通路抑制劑GANT-61均購(gòu)自德國(guó)Merck公司，DMSO溶解至保存濃度保存。

2.細(xì)胞分組:設(shè)置GANT-61的濃度依次為0、10、50、100μmol/L，細(xì)胞株按孵育時(shí)間的不同分為24、48h。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組內(nèi)均采用110、50、100μmol/L濃度處理細(xì)胞，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

3.CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖活性：將96孔板中處理組及對(duì)照組細(xì)胞約1×106鋪入各孔，將培養(yǎng)體系調(diào)整為100μl培養(yǎng)24、48h后向每孔加入10μl CCK-8溶液在37℃培養(yǎng)箱中孵育1h后，測(cè)定吸光光度值，酶標(biāo)儀波長(zhǎng)調(diào)至450nm。

4.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡：取待測(cè)細(xì)胞5×105個(gè)，PBS洗滌離心，加入500μl Binding Buffer、5μl Annexin Ⅴ和5μl PI，30min后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

5.克隆形成檢測(cè)細(xì)胞存活:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，使用甲基纖維素半固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，采用不同濃度GANT-61處理后，在培養(yǎng)24、48h后使用倒置顯微鏡觀察克隆形成情況，克隆形成率(%)=(集落形成個(gè)數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100%。

6.Western blot法檢測(cè)細(xì)胞表達(dá):吸取待測(cè)細(xì)胞約5×106個(gè)左右，離心后取細(xì)胞，采用細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解，采用BCA法測(cè)量蛋白濃度，按照40μg上樣每孔，按照Western blot法測(cè)定GAPDH、pAKT、AKT、NF-κB蛋白表達(dá)水平。

結(jié) 果

1.細(xì)胞增殖活性比較：在GANT-61 10～100μmol/L的不同實(shí)驗(yàn)組中，隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)，HL60/ADR與HL60/RX細(xì)胞抑制率顯著提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。

表1 不同組別的HL60/ADR與HL60/RX細(xì)胞抑制率比較

與0μmol/L比較，*P<0.05；與10μmol/L比較，#P<0.05；與50μmol/L比較，ΔP<0.05

2.細(xì)胞凋亡指數(shù)比較：隨著GANT-61濃度的增加與作用時(shí)間的延長(zhǎng)，HL60/ADR與HL60/RX細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2)。

表2 不同組別的HL60/ADR與HL60/RX細(xì)胞凋亡指數(shù)比較

與0μmol/L比較，*P<0.05；與10μmol/L比較，#P<0.05；與50μmol/L比較，ΔP<0.05

3.克隆形成指數(shù)比較：隨著GANT-61濃度的增加與作用時(shí)間的延長(zhǎng)，HL60/ADR與HL60/RX細(xì)胞的集落生成數(shù)目都顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表3)。

表3 不同組別的HL60/ADR與HL60/RX細(xì)胞集落生成數(shù)目比較

與0μmol/L比較，*P<0.05；與10μmol/L比較，#P<0.05；與50μmol/L比較，ΔP<0.05

4.蛋白表達(dá)比較：隨著GANT-61濃度的增加與作用時(shí)間的延長(zhǎng)，HL60/ADR與HL60/RX細(xì)胞的pAKT表達(dá)顯著下降，NF-κB表達(dá)顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1)。

圖1 不同組別的HL60/ADR與HL60/RX細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)比較

討 論

現(xiàn)代研究表明多條信號(hào)通路相互交叉是難治性AML發(fā)生、發(fā)展的一個(gè)重要機(jī)制[12]。Hedgehog蛋白最早發(fā)現(xiàn)于果蠅胚胎中，其具有3個(gè)同源性基因，包括Deserthedgehog(Dhh)、Sonic hedgehog(Shh)、Indian hedgehog(Ihh)等基因。Hedgehog通路由Hedgehog信號(hào)分子、Smoothened(Smo)、核轉(zhuǎn)錄因子Gli、膜受體patched(PTCH)等作用[13，14]。正常情況下，PTCH與Smo結(jié)合處于失活狀態(tài)[14]。當(dāng)Hedgehog通路激活后，激活的Smo與Gli結(jié)合，Hh配體與PTCH結(jié)合并內(nèi)吞，促使Gli蛋白進(jìn)入核內(nèi)持續(xù)性激活，啟動(dòng)下游靶基因轉(zhuǎn)錄[15]。Hedgehog通路是胚胎發(fā)育和器官形成過(guò)程中重要的信號(hào)通路蛋白，在細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育、損傷修復(fù)再生中發(fā)揮重要作用，Hedgehog通路也是腫瘤細(xì)胞生成、轉(zhuǎn)移、增殖中重要的信號(hào)傳導(dǎo)通路。Hedgehog通路中Smo的特異阻斷劑環(huán)巴胺對(duì)淋巴瘤有顯著抑制作用，但對(duì)AML的作用卻不顯著[16]。Gli作為Hedgehog通路的關(guān)鍵物質(zhì)，當(dāng)前一些以Gli為靶點(diǎn)的抑制劑也得以發(fā)現(xiàn)。GGANT-6可以干擾Gli蛋白與細(xì)胞核內(nèi)DNA的結(jié)合，從而下調(diào)Hedgehog通路的作用[17]。本研究顯示隨著GANT-61濃度的增加與作用時(shí)間的延長(zhǎng)，HL60/ADR與HL60/RX細(xì)胞的凋亡指數(shù)與細(xì)胞增殖抑制率顯著提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。相關(guān)研究也表明Hedgehog通路的Gli蛋白表達(dá)與急性髓細(xì)胞白血病患者的無(wú)病生存率、無(wú)復(fù)發(fā)生存率、總生存率呈負(fù)相關(guān)，抑制該通路表達(dá)可以提高抗腫瘤治療作用[18]。

Hedgehog是哺乳動(dòng)物體內(nèi)廣泛存在的一種分泌性蛋白，Hedgehog通路與腫瘤細(xì)胞的凋亡、血管形成、增殖、分化密切相關(guān)，當(dāng)Hedgehog通路調(diào)節(jié)失控，促使Gli蛋白持續(xù)性激活、啟動(dòng)下游靶基因轉(zhuǎn)錄[19]。當(dāng)使用抑制劑阻滯Hedgehog通路轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑后，抵抗射線的細(xì)胞對(duì)射線的敏感度顯著提高，提示Hedegehog通路在難治性AML治療抵抗方面可能發(fā)揮重要作用[20]。集落生成實(shí)驗(yàn)可反映單個(gè)腫瘤細(xì)胞增殖能力，其中單個(gè)細(xì)胞體外增殖6代以上，其后代形成的細(xì)胞集落被稱為克隆。本研究顯示隨著GANT-61濃度的增加與作用時(shí)間的延長(zhǎng)，HL60/ADR與HL60/RX細(xì)胞的集落生成數(shù)目都顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。相關(guān)研究表明GANT-61可直接作用于Hedgehog通路的轉(zhuǎn)錄因子Glil/2，特異性地阻滯Glil/2所介導(dǎo)的下游靶基因激活，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[21]。還有研究表明Hedgehog通路阻斷劑Cyclopamine也顯著降低效應(yīng)蛋白Gli-1的表達(dá)水平，繼而顯著增加胰腺癌細(xì)胞的放射敏感度，表現(xiàn)為腫瘤的放射效應(yīng)顯著增加，因此推測(cè)該信號(hào)通路將會(huì)是臨床上增加難治性AML放射敏感度的潛在靶點(diǎn)[22]。

Hedgehog通路與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、促進(jìn)血管形成密切相關(guān)，參與白血病的發(fā)生、發(fā)展。Hedgehog通路的下游靶基因主要包括癌基因N-myc、AKT、NF-κB等[23]。研究表明Hedgehog通路可以通過(guò)PI3K/AKT途徑來(lái)行使促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、遷移作用，并與NF-κB信號(hào)活化具有相互促進(jìn)作用[24]。腫瘤細(xì)胞PI3K/AKT信號(hào)通路可以通過(guò)激活多種下游靶蛋白而發(fā)揮其功能，其中pAKT激活I(lǐng)κB激酶，降解IκB而使NF-κB活化進(jìn)入細(xì)胞核而促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。相關(guān)研究也表明PI3K/AKT通路的活化與腫瘤的耐藥和放射抵抗均有相關(guān)性，抑制該通路的活性可以逆轉(zhuǎn)細(xì)胞的耐藥性，增強(qiáng)放射敏感度。本研究顯示隨著GANT-61濃度的增加與作用時(shí)間的延長(zhǎng)，HL60/ADR與HL60/RX細(xì)胞的pAKT表達(dá)顯著下降，NF-κB表達(dá)顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明抑制Hedgehog通路可抑制AKT的活化，使得NF-κB轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)行使其功能，從而抑制細(xì)胞增殖與促使腫瘤細(xì)胞凋亡。

綜上所述，Hedgehog通路可以通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/AKT/NF-κB途徑，抑制難治性AML細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞調(diào)查，對(duì)臨床治療難治性AML提供一個(gè)潛在的有效方法。