范才波 程闊菊 彭 雷 羅 云

臨床和基礎(chǔ)研究已證實(shí)柴胡疏肝散能顯著改善胃腸功能紊亂，主要表現(xiàn)為改善胃腸運(yùn)動(dòng)功能，但具體的作用機(jī)制尚不明確[1,2]。縫隙連接是具有電信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和物質(zhì)交換功能的細(xì)胞連接方式之一，而縫隙連接蛋白是其最基本的結(jié)構(gòu)和功能單位[3]。胃腸神經(jīng)-cajal間質(zhì)細(xì)胞(interstitial cells of cajal,ICC)-平滑肌細(xì)胞通過(guò)ICC形成完整的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，并成為胃腸運(yùn)動(dòng)的基本功能單元[4,5]?？p隙連接蛋白43(connexin43,CX43)是該網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中最重要的縫隙連接蛋白，對(duì)胃腸運(yùn)動(dòng)的電信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)節(jié)起著重要作用，電信號(hào)的傳播會(huì)因?yàn)镃X43的減少或缺失而受到抑制，從而影響胃腸道的舒縮運(yùn)動(dòng)[6]。本研究擬從胃竇肌層CX43的表達(dá)變化來(lái)探討柴胡疏肝散改善胃腸功能紊亂的作用及機(jī)制，從而為臨床應(yīng)用提供部分科學(xué)的理論依據(jù)。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:雄性健康SD大鼠(SPF級(jí))，體重230±20g，由成都達(dá)碩生物科技有限公司提供，合格證號(hào)為SCXK(川2008-24)。

2.主要設(shè)備與試劑:柴胡疏肝散各味藥材購(gòu)自達(dá)州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中藥房，均附鑒定證書和合格證書，利血平購(gòu)自天津金耀藥業(yè)有限公司(批號(hào)：1501161)，轉(zhuǎn)錄子一期分離試劑(transcriptor first tripure isolation reagent)、LightCycler 480 SYBR Green I Master均購(gòu)自瑞士Roche公司，一抗：CX43、β-actin(細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，Cell Signaling)，熒光二抗、DAPI購(gòu)自谷歌生物公司,LightCycler480購(gòu)自瑞士Roche公司，Odyssey掃描成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)LI-COR公司，倒置熒光顯微鏡(Eclipse Ti-SR)購(gòu)自日本Nikon公司，透射電子顯微鏡(HT7700)購(gòu)自日本日立公司，切片機(jī)(型號(hào)UC7)購(gòu)自德國(guó)Leica公司，鉆石切片刀(Daitome,Ultra 45°)。

3.藥物制備：柴胡疏肝散[7]湯劑由陳皮、柴胡各120g，川芎、枳殼(麩炒)、芍藥各90g，甘草(炙)30g，香附90g組成。藥材經(jīng)清洗后溫水1000ml浸泡1h，后煎煮30min，提取2次，再合并水煎液，冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

4.模型制備及分組:實(shí)驗(yàn)分組:取雄性健康SD大鼠80只，采用隨機(jī)數(shù)字表法分成4組，即空白對(duì)照組(對(duì)照組)、胃腸功能紊亂模型組(模型組)、對(duì)照+藥物組、模型+藥物組，每組分別為20只。模型制備參考英振昊的方法，按照0.5mg/(kg·d)的劑量連續(xù)腹腔注射利血平14天；對(duì)照組腹腔注射同等劑量的生理鹽水[8]。給藥方法：藥物組按照每只大鼠30ml/(kg·d)的柴胡疏肝散湯劑劑量，分兩次早晚灌服大鼠，于造模同時(shí)進(jìn)行，連續(xù)14天，對(duì)照組給予等量滅菌注射用水灌胃。

模型制備是否成功的判定方法：(1)胃竇組織免疫組化：胃竇組織于4%多聚甲醛中固定，乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，HE染色，脫水封片，光學(xué)顯微鏡下觀察記錄。(2)胃生物電檢測(cè)：大鼠經(jīng)戊巴比妥麻醉后仰臥位固定，劍突下腹部正中切口，在胃竇距離幽門0.5cm處的漿膜下安置電極，電極另一端連接BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，記錄在體慢波并計(jì)算其頻率、振幅、慢波頻率變異系數(shù)和慢波振幅變異系數(shù)。(3)胃排空實(shí)驗(yàn)：禁食36h后給予營(yíng)養(yǎng)半固體飲食3ml，30min后取胃，稱重計(jì)量為M1，剪開(kāi)胃體，清除胃內(nèi)容物，用濾紙吸干水分稱重為M2，計(jì)算胃殘留率：(M1-M2)/2×100%。

5.實(shí)時(shí)PCR 檢測(cè)：待胃運(yùn)動(dòng)功能檢測(cè)結(jié)束后，剝離胃竇黏膜，將肌層組織迅速放入經(jīng)液氮預(yù)冷的無(wú)酶EP管(預(yù)先已放入研磨珠子)中，在研磨器中對(duì)組織進(jìn)行充分粉粹研磨。研磨結(jié)束后，向EP管中加入1ml三純分離試劑(tripure isolation reagent)，然后按照其說(shuō)明書提取RNA，接著按照第一主選DNA合成試劑盒《Transcriptor First Stand cDNA Synthsis Kit》說(shuō)明書將RNA 反轉(zhuǎn)成cDNA，然后于LightCycler?480儀器上對(duì)CX43進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增檢測(cè)，內(nèi)參為β-actin。建立待測(cè)基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線和待測(cè)樣品的Ct值，據(jù)此計(jì)算出 SQ 值(起始量)，再計(jì)算CX43基因的相對(duì)表達(dá)量：CX43基因的相對(duì)表達(dá)量=CX43基因的起始量/β-actin基因的起始量。實(shí)時(shí)PCR引物相關(guān)信息詳見(jiàn)表1。

表1 CX43、β-actin實(shí)時(shí)PCR引物相關(guān)信息

6.Western blot法檢測(cè)：胃竇肌層組織的粉粹研磨同上，組織研磨結(jié)束后每EP管加入1ml 預(yù)冷的RIPA 緩沖裂解液，置冰上用超聲裂解儀充分裂解組織，于4℃下12000×g離心30min，收集上清液即為細(xì)胞的總蛋白溶解液，對(duì)蛋白濃度定量后加入SDS/PAGE煮沸5min變性蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜，后續(xù)加入CX43、β-actin(大鼠)一抗及相應(yīng)的二抗。采用Odyssey 掃描成像系統(tǒng)(美國(guó)LI-COR公司)對(duì)蛋白進(jìn)行定量分析。

7.免疫熒光檢測(cè)：剝離大鼠胃竇肌層，經(jīng)丙酮固定→常規(guī)乙醇逐級(jí)脫水→二甲苯透明→石蠟包埋→切片→脫蠟→抗原修復(fù)→畫圈自發(fā)熒光淬滅→血清封閉→加一抗→加二抗→DAPI復(fù)染細(xì)胞核→熒光淬滅劑封片，于倒置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

8.電鏡檢測(cè)：取大鼠胃竇肌層不超過(guò)1mm×1mm×1mm組織，迅速投入電鏡固定液4℃中固定2～4h，0.1mol/L PBS漂洗，再用1%的鋨酸室溫固定2h，0.1mol/L PBS漂洗，不同濃度的乙醇-丙酮梯度脫水，經(jīng)丙酮滲透、樹脂聚合、60～80nm超薄切片，鈾鉛雙染色后置透射電鏡下觀察。

結(jié) 果

1.模型制備:造模結(jié)束后模型組大鼠胃竇組織病理學(xué)表現(xiàn)為無(wú)器質(zhì)性病變(圖1)；胃運(yùn)動(dòng)功能表現(xiàn)為慢波頻率及振幅下降(生物電檢測(cè),P<0.05)、胃排空減慢(胃殘留率增多,P<0.05,表2)，根據(jù)模型組大鼠的胃組織病理學(xué)及運(yùn)動(dòng)功能表現(xiàn)，可判定模型制作成功。

圖1 大鼠胃腸功能紊亂動(dòng)物模型胃和結(jié)腸的組織病理學(xué)表現(xiàn)(HE染色，×200)A.對(duì)照組；B.對(duì)照+藥物組；C.模型組；D.模型+藥物組

表2 大鼠胃腸功能紊亂動(dòng)物模型胃運(yùn)動(dòng)功能檢測(cè)

與對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

2.柴胡疏肝散對(duì)胃腸功能紊亂大鼠胃竇肌層CX43 mRNA表達(dá)量的影響:模型組大鼠胃竇肌層CX43的mRNA表達(dá)量顯著減少(P<0.05)；柴胡疏肝散對(duì)正常大鼠胃竇肌層CX43 mRNA表達(dá)量無(wú)影響(P>0.05)，但可顯著上調(diào)胃腸功能紊亂大鼠胃竇肌層CX43 mRNA表達(dá)量(P<0.05)，詳見(jiàn)圖2。

3.柴胡疏肝散對(duì)胃腸功能紊亂大鼠胃竇肌層CX43蛋白表達(dá)的影響:模型組大鼠胃竇肌層CX43的蛋白表達(dá)量顯著減少(P<0.05)；柴胡疏肝散對(duì)正常大鼠胃竇肌層CX43 的蛋白表達(dá)量無(wú)影響(P>0.05)；但可顯著上調(diào)胃腸功能紊亂大鼠胃竇肌層CX43 的蛋白表達(dá)量(P<0.05)，詳見(jiàn)圖3。

圖2 柴胡疏肝散對(duì)胃腸功能紊亂大鼠胃竇肌層CX43 mRNA表達(dá)的影響與對(duì)照組比較,*P<0.05；與模型組比較,#P<0.05

圖3 柴胡疏肝散對(duì)胃腸功能紊亂大鼠胃竇肌層CX43蛋白表達(dá)的影響與對(duì)照組比較,*P<0.05；與模型組比較,#P<0.05

4.柴胡疏肝散對(duì)胃腸功能紊亂大鼠胃竇肌層CX43 免疫熒光的影響:熒光顯微鏡下觀察，正常大鼠(對(duì)照組)胃竇肌層內(nèi)可見(jiàn)均勻的CX43陽(yáng)性表達(dá)；對(duì)照+藥物組與對(duì)照組類似；模型組CX43陽(yáng)性表達(dá)顯著減少；模型+藥物組中CX43陽(yáng)性表達(dá)較模型組顯著增多,詳見(jiàn)圖4。

圖4 柴胡疏肝散對(duì)胃腸功能紊亂大鼠胃竇肌層CX43免疫熒光的影響(×400)A.對(duì)照組；B.對(duì)照+藥物組；C.模型組；D.模型+藥物組

5.柴胡疏肝散對(duì)胃腸功能紊亂大鼠胃竇肌層CX43透射電鏡的影響：透射電鏡下觀察，正常大鼠(對(duì)照組)胃竇肌層內(nèi)腸神經(jīng)-ICCs-平滑肌網(wǎng)絡(luò)中腸神經(jīng)與ICCs、ICCs相互之間、ICCs與平滑肌細(xì)胞以及平滑肌細(xì)胞相互之間存在完整的縫隙連接；對(duì)照+藥物組與對(duì)照組類似；模型組胃竇肌層內(nèi)腸神經(jīng)-ICCs-平滑肌網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)存在較大縫隙，較少發(fā)現(xiàn)有縫隙連接；模型+藥物組腸神經(jīng)-ICCs-平滑肌網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)之間的連接基本保持完整,詳見(jiàn)圖5。

圖5 柴胡疏肝散對(duì)胃腸功能紊亂大鼠胃竇肌層CX43 透射電鏡的影響(5μm)A.對(duì)照組；B.對(duì)照+藥物組；C.模型組；D.模型+藥物組

討 論

胃腸功能紊亂是臨床上常見(jiàn)的非器質(zhì)性功能性胃腸道疾病，以胃腸道運(yùn)動(dòng)功能障礙為主，臨床上表現(xiàn)為無(wú)器質(zhì)性病變的腹痛、腹瀉、便秘等消化系統(tǒng)癥狀，發(fā)生率約為40%，約占胃腸道疾病的40%～60%，并呈逐年上升的趨勢(shì)[9，10]。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，臨床上缺乏有效的化學(xué)藥物。臨床和基礎(chǔ)研究顯示柴胡疏肝散能顯著改善胃腸功能紊亂癥狀，但其具體的作用機(jī)制尚不明確[2,11]。隨著我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)在全球范圍逐步得到認(rèn)同，更多的國(guó)外研究者要求我國(guó)的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)能提供現(xiàn)代的科學(xué)理論依據(jù)。

正常的胃腸運(yùn)動(dòng)功能源于正常的胃腸蠕動(dòng)，而正常的胃腸蠕動(dòng)依賴于規(guī)律的慢波電位，研究證實(shí)腸肌間神經(jīng)叢ICC (myentericICC,ICC-MY)是胃腸道內(nèi)慢波電位的起博者，以突觸小體的方式將慢波電位傳遞給與肌內(nèi) ICC(intramuscular ICC，ICC-IM)和深肌層叢ICC(deep muscular plexus ICC,ICC-DMP)[12]。ICC-IM、ICC-DMP以縫隙連接的方式將慢波電位傳遞給平滑肌細(xì)胞，最終由平滑肌細(xì)胞執(zhí)行胃腸道的舒縮功能[13]。ICC同樣以突出小體的形式與胃腸道自主神經(jīng)和腸神經(jīng)系統(tǒng)相連，將其興奮性或抑制性信號(hào)傳遞給平滑肌，從而起到調(diào)節(jié)胃腸道平滑肌收縮的作用[14]。因此，胃腸神經(jīng)-ICC-平滑肌細(xì)胞通過(guò)ICC形成完整的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，并成為胃腸運(yùn)動(dòng)的基本功能單元。

縫隙連接蛋白43(connexin43,CX43)是ICC與平滑肌細(xì)胞及平滑肌與平滑肌細(xì)胞間最重要的縫隙連接蛋白，因此對(duì)胃腸運(yùn)動(dòng)的電信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和平滑肌細(xì)胞的收縮起著重要作用[15]。電信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)會(huì)因?yàn)镃X43的減少或缺失而受到抑制，從而影響胃腸道的舒縮運(yùn)動(dòng)。如張國(guó)山[16]報(bào)道在功能性消化不良的大鼠模型中，模型大鼠胃腸道內(nèi)的CX43表達(dá)顯著減少。吳全霞等[17]研究證實(shí)在糖尿病胃輕癱的大鼠模型中，胃竇肌層中的CX43表達(dá)顯著減少或缺失，證實(shí)在胃腸運(yùn)動(dòng)功能障礙中，胃腸道內(nèi)CX43的表達(dá)量會(huì)減少或缺失，也可以從另一方面說(shuō)明可能正是由于CX43的減少或缺失導(dǎo)致慢波電位不能順利地從ICC-IM、ICC-DMP傳播到平滑肌細(xì)胞以及在平滑肌細(xì)胞間的傳播，進(jìn)而導(dǎo)致胃腸道的舒縮障礙。因此，通過(guò)上調(diào)胃腸道肌層內(nèi)CX43的表達(dá)而調(diào)解慢波電位在胃腸道平滑肌細(xì)胞間的傳播，將有效的治療由胃腸道舒縮障礙導(dǎo)致的胃腸功能紊亂。

本研究利用腹腔注射利血平成功制備胃腸功能紊亂大鼠模型，胃運(yùn)動(dòng)功能表現(xiàn)為慢波頻率及振幅下降、胃排空減慢，利用實(shí)時(shí)PCR、Western blot、組織免疫熒光技術(shù)顯示在模型組大鼠的胃竇肌層中CX43的表達(dá)顯著減少，同時(shí)透射電鏡觀察到ICC與平滑肌細(xì)胞以及平滑肌與平滑肌細(xì)胞間的縫隙連接顯著減少，細(xì)胞間的間隙顯著變大，再次證明了在胃腸運(yùn)動(dòng)功能障礙中，會(huì)伴隨著CX43的減少或缺失。應(yīng)用柴胡疏肝散干預(yù)后，胃竇肌層CX43表達(dá)顯著增多，ICC與平滑肌細(xì)胞以及平滑肌與平滑肌細(xì)胞間的縫隙連接增多，細(xì)胞間的間隙顯著變小，整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)為胃運(yùn)動(dòng)功能得到顯著改善，表明柴胡疏肝散能通過(guò)CX43的表達(dá)增加ICC與平滑肌細(xì)胞以及平滑肌與平滑肌細(xì)胞間的縫隙連接，調(diào)解慢波電位從ICC-IM、ICC-DMP到平滑肌細(xì)胞以及在平滑肌細(xì)胞間的傳播，從而改善胃腸蠕動(dòng)。

綜上所述，柴胡疏肝散可通過(guò)上調(diào)胃竇肌層內(nèi)CX43的表達(dá)而促進(jìn)慢波電位的傳播，從而改善胃腸功能紊亂，但其具體調(diào)解機(jī)制包括對(duì)胃腸激素等的影響等尚需進(jìn)一步研究。