李永光 趙 雨 趙麗杰 周慧軒 劉向東 張慶勇 沈成興 魏 盟

高血壓是一個重要的公共健康問題，它與心血管疾病風險密切相關(guān)，可以誘導血管平滑肌細胞增殖及遷移[1]。而血管平滑肌細胞(VSMCs)的增殖在血管變化(包括血管重塑)中起到了重要作用。雖然針對血管平滑肌細胞增殖研究的藥物不斷進展，但仍是臨床上一個主要挑戰(zhàn)。在這種情況下，信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT3)得到了不斷研究，它是一種潛在的治療血管平滑肌細胞增殖的藥物。在VSMCs中STAT3信號通路的激活促進了VSMCs的增殖[2]。

STAT3，作為STAT 7個家族成員中的一個轉(zhuǎn)錄因子，可以受到眾多細胞因子，生長因子以及激素調(diào)節(jié)，其中包括IL-6、表皮生長因子(EGF)和瘦素的調(diào)節(jié)[3,4]。當受到外界刺激時，STAT3可以通過非酪氨酸激酶受體，如JAK2和Src激活，同時也可以受到Sirt1和其他小分子調(diào)控，如細胞因子抑制信號3(SOCS3)調(diào)控，然后活化的STAT3形成二聚體，轉(zhuǎn)運到細胞核，并在核內(nèi)調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄和表達[5]。STAT3參與生理反應和病理的變化，如血管狹窄和動脈壁的增厚，血管平滑肌細胞STAT3受到外界影響因素而激活，從而影響細胞增殖及凋亡，大量的研究證明STAT3具有促增殖功能。其中STAT3在肺動脈高壓中活化，另外，凝血酶和IFN-γ通過STAT3信號通路調(diào)控平滑肌細胞增殖，同時參與調(diào)控平滑肌細胞增殖相關(guān)的基因cyclin B1以及存活因子(Bcl-2)表達[5,6]。因此STAT3目前被認為是VSMCs抗增殖的潛在的分子靶點。

白藜蘆醇是在葡萄和其他食物中發(fā)現(xiàn)的一種多酚類二苯乙烯衍生物，其表現(xiàn)出抑制增殖作用。在腫瘤研究中，白藜蘆醇拮抗增殖作用主要是通過抑制STAT3信號通路來起作用[7,8]。除了白藜蘆醇在腫瘤中的功能，白藜蘆醇具有多種生物學性質(zhì)，包括拮抗增殖、炎癥、細胞肥大以及分化[9]。然而，白藜蘆醇在平滑肌中的作用以及和STAT3在其中增殖方面扮演的角色還沒有被研究。在本研究中，評估了血管平滑肌細胞中，白藜蘆醇的抗增殖作用以及和STAT3信號通路的分子機制。

材料與方法

1.試劑:白藜蘆醇和MTT購自美國Sigma公司?？贵wSTAT3，P-STAT3(Tyr705)購自美國Cell Signaling Technology公司?？贵wGAPDH購自美國Santa Cruz Biotechnology公司。 二抗購自Biosynthesis Biotechnology公司。青霉素、鏈霉素、DMEM以及胎牛血清購自美國Gibco公司。

2.細胞及處理條件：血管平滑肌細胞保持在高濃度葡萄糖(4.5g/L)，L-谷氨酰胺和丙酮酸鈉的DMEM/F12中，其中含有10%胎牛血清，100單位/毫升青霉素-鏈霉素。原代主動脈血管平滑肌細胞通過體外生長方法獲得。主動脈從10～12周齡的Wistar大鼠獲得。在無菌條件下取出Wista大鼠主動脈降段，用D-Hanks液洗去血污；分離中膜和外膜，并將其平鋪于平皿上，用刀切碎成1mm3小塊；然后接種于培養(yǎng)瓶中，加入含有20%的胎牛血清的DMEM-F12的培養(yǎng)液，置于37℃恒溫箱中；每3天換液1次，待細胞從組織塊爬出后，移棄組織塊；VSMCs傳至第6～10代時用于實驗。在處理之前，將細胞血清饑餓24h，并以5×105細胞密度接種于6孔板中。進而研究白藜蘆醇對血管平滑肌細胞功能的影響。VSMCs分為實驗組和對照組，對照組以無DMSO及白藜蘆醇組作為對照。加入白藜蘆醇實驗濃度，培養(yǎng)24h，然后收集細胞，并利用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(實時定量PCR)和免疫印跡分析方法途徑檢測細胞增殖和細胞信號的變化。

3.蛋白免疫印跡:Western blot法免疫印跡分析根據(jù)之前的步驟稍作修改[10]。蛋白通過SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(Novex, 美國Invitrogen公司)，然后利用5%脫脂牛奶，室溫封閉1h。待封閉結(jié)束以后，膜利用抗體STAT3,P-STAT3 Tyr705 (Tyr705)，和GAPDH(美國Santa Cruz公司)。待孵育結(jié)束，利用二抗孵育結(jié)合。然后印跡利用增強化學發(fā)光檢測試劑(美國Thermo Scientific公司)檢測，然后條帶利用Quantity One軟件定量分析(美國BioRad公司)。

4.反轉(zhuǎn)錄PCR分析：血管平滑肌細胞利用白藜蘆醇(1μmol/L和100μmol/L)處理24h后，提取總RNA。利用TRIzol?試劑(美國Life Technologies公司)，并根據(jù)說明書進行提取。RNA利用分光光度計在260nm處進行定量分析，并根據(jù)A260/280的比值確定，其純度通過在變性瓊脂糖凝膠中評估。cDNA合成根據(jù)制造商的說明書進行。合成cDNA后，PCR反應包括32個循環(huán)：95℃，30s，退火溫度為56℃ 30s，72℃，30s；最后一個周期在72℃延長5min。最后PCR產(chǎn)物通過電泳在2%的瓊脂糖凝膠并通過溴化乙錠染色顯現(xiàn)。每個樣品重復3次，至少有3個反應用于計算?；蛞镄蛄斜韰⒁姳?，另外，β-actin作為內(nèi)參。吸光度用凝膠成像3.74系統(tǒng)檢測相對表達。

表1 本研究中使用的寡核苷酸引物序列

F.正向引物；R.反向引物

5.細胞增殖檢測:利用MTT方法檢測細胞增殖。血管平滑肌細胞以1×104個細胞/孔接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，血清饑餓24h。然后加入白藜蘆醇處理24h，再加入含有MTT的磷酸鹽緩沖液進去，MTT最終濃度是0.5mg/ml，然后37℃，孵育4h。最后將培養(yǎng)基輕輕吸棄，并每孔中加入DMSO 150μl。然后將板放在搖床上搖晃10min，使產(chǎn)物最終溶解。利用含有DMSO孔作為空白對照，然后利用分光光度計(美國BioTek公司)，測量490nm處的吸光度值。

結(jié) 果

MTT法用來檢測血管平滑肌細胞增殖能力。在血清饑餓24h后，依據(jù)實驗條件，利用不同濃度的白藜蘆醇(1、100μmol/L)加入平滑肌細胞中進行孵育24h，然后MTT法來檢測分析。和對照組比較，白藜蘆醇組(100μmol/L)處理可以抑制血管平滑肌細胞增殖(P<0.05，圖1)。

為進一步研究白藜蘆醇對STAT3信號通路的調(diào)控作用，經(jīng)過不同濃度的白藜蘆醇(1、100μmol/L)處理24h后，利用蛋白免疫印跡方法檢測STAT3及STAT3-Tyr705磷酸化改變情況，其中STAT3-Tyr705磷酸化參與血管平滑肌細胞增殖。和對照組比較，白藜蘆醇(1、100μmol/L)可抑制STAT3-Tyr705磷酸化，其中高濃度白藜蘆醇組抑制作用更明顯(P<0.05，圖2)。

圖1 不同濃度白藜蘆醇對平滑肌細胞增殖的作用與對照組比較，*P<0.05

圖2 白藜蘆醇對STAT3信號通路的作用A.不同濃度的白藜蘆醇對P-STAT3信號通路的作用；B.STAT3-Tyr705與GAPDH比較；C.STAT3與GAPDH比較；與對照組比較，*P<0.05

同時為進一步了解STAT3-Tyr705相關(guān)下游基因的改變情況，對和細胞增殖相關(guān)的cyclinB1、Bcl-2進行研究，研究顯示經(jīng)過白藜蘆醇處理24h后的血管平滑肌細胞下游基因cyclinB1、Bcl-2實驗組較對照組明顯下調(diào)(P<0.05,圖3A)。此外，STAT3相關(guān)的基因SOCS3(負反饋抑制STAT3磷酸化)也得到了研究，轉(zhuǎn)錄水平研究提示SOCS3在白藜蘆醇高濃度處理組 (100μmol/L)較對照組明顯升高，而低濃度組差異并無統(tǒng)計學意義(P<0.05,圖3B)。

圖3 白藜蘆醇對STAT3下游信號通路的調(diào)控A.下游基因cyclinB1及Bcl-2的作用。利用反轉(zhuǎn)錄PCR檢測STAT3相關(guān)的靶基因cyclinB1和Bcl-2其中β-actin作為內(nèi)參；B.下游基因SOCS3的作用。顯示和STAT3相關(guān)的靶基因SOCS3，其中β-actin作為內(nèi)參，與對照組比較，*P<0.05

討 論

體外研究證明白藜蘆醇抑制血管平滑肌細胞增殖，同時探討研究其分子機制。白藜蘆醇抑制血管平滑肌細胞增殖，同時抑制STAT3的轉(zhuǎn)錄活性以及相關(guān)靶基因。該研究證明STAT3可能是白藜蘆醇的一個靶點。因此本研究結(jié)果表明白藜蘆醇可能通過抑制STAT3活性來起作用。該研究證明白藜蘆醇抑制p-STAT3信號通路，同時抑制VSMCs增殖。

白藜蘆醇是一種天然多酚，是植物自然產(chǎn)生的一種抗毒素。白藜蘆醇具有多種益處，預防癌癥，保護心血管，拮抗炎癥以及抗糖尿病作用[11]。而其拮抗增殖活性是通過抑制NF-κB、ER以及Cx43磷酸化來起作用[12,13]。然而白藜蘆醇的抗增殖功能不能僅僅從這幾個轉(zhuǎn)錄因子就解釋清楚，其抗增殖作用機制依然需要進一步闡述和證明。在本項研究中白藜蘆醇抑制VSMCs增殖。進一步證明了在VSMCs中STAT3是白藜蘆醇調(diào)控的靶基因。白藜蘆醇抑制STAT3磷酸化，可能是通過調(diào)控SOCS3的表達來起作用。因此筆者的研究證明，在VSMCs中STAT3是白藜蘆醇調(diào)控的一個新靶點。

在VSMCs中作用于STAT3活性的因子有很多是通過抑制或者激活STAT3上游信號分子來起作用，如Src、JAK2[14,15]。這些信號分子導致的細胞增殖是通過STAT3下游靶基因來起作用的。STAT3已經(jīng)證明是一個拮抗增殖的靶點。在該研究中，白藜蘆醇可以抑制STAT3磷酸化，同時上調(diào)SOCS3，因此在VSMCs中，白藜蘆醇抑制STAT3磷酸化以及其下游靶基因，可能是通過上調(diào)SOCS3反饋抑制STAT3磷酸化來起作用。該機制在VSMCs中首次發(fā)現(xiàn)。另外白藜蘆醇和STAT3的關(guān)系以及在VSMCs中的作用在心血管疾病中十分重要，因此需要進行更深入研究，從而證明白藜蘆醇對STAT3的作用是通過SOCS3反饋調(diào)節(jié)來起作用。

近年來研究人員對中草藥的抗增殖以及抗炎癥作用進行了評估，這些藥物包括姜黃色素、茶多酚、維生素E以及白藜蘆醇[16,17]。天然化合物因為其生長抑制以及在炎癥中的作用變得越來越有吸引力。因此研究白藜蘆醇在VSMCs中的作用顯得越來越重要。近年來研究顯示，STAT3在增殖以及細胞活性方面起到了重要作用，包括抗凋亡分子如Bcl-2和survivin。并通過下調(diào)相關(guān)基因Nox1、Nox4和MCP-1基因，從而調(diào)控血管平滑肌細胞增生[18]。因此抑制STAT3活性可以抑制血管平滑肌細胞增殖。然而盡管如此，在血管平滑肌細胞中白藜蘆醇對p-STAT3作用尚未被報道。在該研究中，白藜蘆醇抑制p-STAT3信號通路同時作用于SOCS3，并伴隨著VSMCs細胞增殖抑制。p-STAT3信號通路的機制說明白藜蘆醇這種天然化合物是一種有前途的拮抗增殖的試劑。由于白藜蘆醇的抑制濃度(100μmol/L)偏高，因此在防治高血壓平滑肌細胞增殖中，需要更深入的研究。

總之，體外研究證明白藜蘆醇在VSMCs中具有拮抗增殖作用，其活性是部分通過調(diào)控STAT3活性以及其相關(guān)的靶基因來起作用的。同時研究顯示白藜蘆醇對STAT3上游調(diào)節(jié)信號通路作用非常復雜，因此白藜蘆醇在VSMCs中的拮抗增殖作用需要開展進一步研究。