劉騰輝 李 瑾 張 禾 田馨園 蔡劍平

結直腸癌是全球發(fā)生率第3位、病死率第4位的惡性腫瘤，腫瘤的侵襲、轉移是導致患者死亡的主要原因，其發(fā)生、發(fā)展機制仍未完全明了。結直腸癌的主要治療方法是以手術為主的綜合治療，包括新輔助放射治療和輔助化學治療，以及靶向治療等。目前的研究表明DNA、RNA和蛋白質等大分子物質已成為靶向藥物研發(fā)及腫瘤靶向治療的關鍵[1]。

生物體細胞在正常生長發(fā)育過程中會受到內外環(huán)境因素的刺激產生大量的活性氧 (reactive oxygen species, ROS)，對DNA、RNA和游離核苷酸造成氧化損傷[2]。在已檢測到的20多種的氧化堿基中，鳥嘌呤(guanine, G)因具有最低的氧化電勢易被羥自由基氧化生成8-氧化鳥嘌呤(8-oxo-7,8-dihydroguanine，8-oxoG)[3]。8-oxoG可以與腺嘌呤(adenine, A)發(fā)生錯誤配對，其效率幾乎等同于正常配對的胞嘧啶(cytosine, C)[4～6]。因此，8-oxoG的錯配可以導致DNA復制、轉錄及蛋白質翻譯的錯誤。哺乳動物中的MutT 同源蛋白1可以降解含有8-oxoG的核苷酸，包括8-oxo-dGTP和8-oxoGTP，從而保證復制和轉錄的正確性[6,7]。

多項研究證明MTH1蛋白在胃癌、肺癌和食管鱗癌等腫瘤中表達量增加[8～10]。本研究筆者以結腸癌臨床標本為模型，研究了MTH1蛋白在結腸癌組織中表達情況，分析其表達量與臨床病理特征之間的相關性，探討其對結腸癌患者預后判斷的價值。同時利用結腸癌細胞株初步探索了MTH1蛋白在結腸癌發(fā)展中的作用及機制。

材料與方法

1.材料：(1)細胞株及培養(yǎng)基：人胚胎腸黏膜細胞CCC-HIE-2、人結腸癌細胞株HCT116、SW620和LoVo(中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所基礎醫(yī)學細胞中心)；人結腸癌細胞株SW480、Colo320和T84(美國ATCC)；DMEM、IMEM、F-12K、L15、 RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液(美國Gibco公司)。(2)引物及寡核苷酸的合成：針對MTH1的siRNA委托廣州市銳博生物科技有限公司合成，其靶序列為siMTH1：5′-CGACGACAGCTACTGGTTT-3′；MTH1及GAPDH基因實時熒光定量PCR擴增引物由北京天一輝遠生物科技有限公司合成，引物序列為：MTH1上游引物: 5′-CTCAGCGAGTTCTCCTGG-3′；MTH1下游引物: 5′-GGAGTGGAAACCAGTAGCTGTC-3′；GAPDH上游引物: 5′-CCTCTCCAGAACATCATCC-3′； GAPDH下游引物: 5′-GTGTCGCTGTTGAAGTCAG-3′。(3)實驗試劑及儀器：結直腸癌組織芯片(HCol-Ade180Sur-07，上海芯超生物科技有限公司)；兔抗人MTH1多克隆抗體(英國Abcam公司)；鼠抗人GAPDH抗體、羊抗兔辣根過氧化物酶標記二抗、抗體稀釋液、DAB顯色液(北京中杉金橋生物技術有限公司)；TRIzolTMReagent(美國Life Technologies公司)；TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Super-Mix(北京全式金生物技術有限公司)；TanonTMHigh-sig ECL Western blot Substrate、Tanon 5200化學發(fā)光圖像分析系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)； Transwell 24孔小室、基質膠Matrigel Matrix(美國Corning公司)；纖維粘連蛋白(美國Sigma-Aldrich公司)；RIPA普通型裂解液(北京索萊寶科技有限公司)；去鐵胺甲磺酶鹽、DEPC水(美國Sigma-Aldrich公司)；PierceTMBCA Protein Assay Kit(美國Thermo Fisher公司)；Nikon80i正置熒光顯微鏡(日本尼康株式會社)；普通PCR儀(美國AB公司)、定量PCR儀SmartCycler(美國Cephield公司)。(4)其他常規(guī)試劑均來自北京化學試劑公司。

2．方法：(1)結腸癌組織芯片免疫組化：結腸癌芯片脫蠟后、以枸櫞酸緩沖液加熱煮沸進行抗原修復，PBS清洗3次，滴加3%H2O2工作液消除內源性過氧化物酶影響。PBS清洗后以進口山羊血清封閉液封閉30min，1∶300稀釋兔抗人MTH1抗體4℃孵育12h。PBS緩沖液清洗3次，用山羊抗兔IgG/HRP 聚合物室溫孵育20min，DAB顯色液顯微鏡下觀察顯色。蘇木素復染15s合并1%鹽酸酒精分化2s，中性快干膠封片。(2)組織芯片統(tǒng)計學方法：由兩位經驗豐富的病理科醫(yī)生對MTH1染色的結腸癌組織芯片(包括87例癌組織和癌旁組織)進行染色強度和染色面積評分。對于染色強度：無染色計0分、輕度染色計1分、中度染色計2分、重度染色計3分；染色面積：0～25%計1分、25%～50%計2分、50%～75%計3分、75%～100%計4分。最終得分是染色強度×染色面積，其中，乘積低于7為MTH1表達量低，乘積高于7為表達量高。(3)結腸癌細胞中mRNA檢測：于6孔板中培養(yǎng)結直腸癌腫瘤細胞HCT116、SW480、SW620、LoVo、COLO320和T84及人胚胎腸黏膜細胞CCC-HIE-2，待細胞密度達到80%～90%時，棄培養(yǎng)基并用PBS清洗兩遍，于每孔加入1ml Trizol試劑提取總RNA，紫外分光光度計檢測濃度后取1μg總RNA作為模版，反應體系及條件：將RNA模版、引物與RNase-free Water混勻，65℃反應5min，以提高合成效率。加入2× TS Reaction mix、Transcript RT/RI Enzyme mix和gDNA Remover并混勻，分別25℃ 10min，42℃ 15min及85℃ 5s合成cDNA并去除gDNA。以cDNA為模版，加入實驗室合成的引物及2×Transtart TOP/TIP Green Qpcr SuperMix，95℃作為變性條件。定量PCR儀SmartCycler檢測熒光信號。數(shù)據(jù)分析以GAPDH為內參，計算MTH1的相對表達量。(4)結腸癌細胞中蛋白質檢測：RIPA裂解液裂解6孔板中培養(yǎng)的結腸癌腫瘤細胞及人胚胎腸黏膜細胞，4℃ 12000×g離心20min，取上清液。經BCA蛋白定量試劑盒定量。取20μg總蛋白120V恒壓下進行12%SDS-PAGE電泳，260mA恒流2h轉移至PVDF膜，后以5%脫脂奶粉封閉2h，1∶1000稀釋的兔抗人MTH1和鼠抗人GAPDH抗體4℃孵育12h。TBST清洗5次后室溫孵育1∶2000稀釋的羊抗兔及羊抗鼠二抗1h，TBST洗液清洗3次后，使用TanonTMHigh-sig ECL Western blot Substrate配合X線片曝光檢測。(5)用siRNA針對MTH1基因瞬時干擾腫瘤細胞：轉染前12h于12孔板內鋪細胞HCT116(1×105個/孔)、LoVo(2×105個/孔)，先將無血清培養(yǎng)基與RNA-MAX混合，室溫放置5min。待siRNA與無血清培養(yǎng)基混合均勻。將上述RNA-MAX與siRNA混合均勻，室溫放置15min后，加入無抗生素的培養(yǎng)基于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每種細胞各轉染3個孔作為重復，并設立3個無siRNA陰性對照。轉染72h后，提取總蛋白，用Western blot法檢測敲減效果。(6)細胞增殖能力驗證：轉染前12h于24孔板內鋪細胞HCT116(5×104個/孔)、LoVo(1×105個/孔)，轉染細胞。37℃培養(yǎng)24h后，胰酶消化重懸細胞并于96孔板內鋪細胞HCT116(5×103個/孔)、LoVo(1×104個/孔)，各重復6孔。分別培養(yǎng)24、48、72和96h后，于相應時間點每孔加入10μl CCK試劑，37℃孵育1h，Tecan GENios 多功能酶標儀檢測450nm吸光度值。(7)細胞遷移及侵襲能力驗證：在Transwell小室外側底部滴加50μl濃度為10μg/ml 的纖維粘連蛋白，并使其均勻覆蓋小室底部，在超凈臺放置2h使其自然晾干。用冷的無血清培養(yǎng)基將提前冰上融化的Matrigel稀釋至濃度為200μg/ml，充分吹打混勻后吸取100μl，加入經纖維粘連蛋白預處理的小室，放入37℃培養(yǎng)箱4h備用(細胞遷移不需加入Matrigel)。胰酶消化瞬時敲減MTH1的HCT116及LoVo細胞，并使用無血清培養(yǎng)基重懸細胞、計數(shù)。于24孔板中加入700μl含20%FBS的培養(yǎng)基，將纖維粘連蛋白及Matrigel預處理的小室(細胞遷移只需使用經纖維粘連蛋白預處理的小室)放入其中，小室內側分別加入濃度為2.5×105/ml的HCT116及濃度為5×105/ml的LoVo各200μl，吹打混勻，37℃孵育48h。后吸棄小室內培養(yǎng)基，PBS清洗2次，將小室放入4%多聚甲醛中固定30min。PBS清洗2次后，以1%結晶紫染色1h，PBS清洗3次后，用棉簽輕輕拭去小室內側底部細胞。顯微鏡下觀察小室外側底部細胞，在200倍鏡下隨機選取10個視野進行計數(shù)后求得平均值。

3.統(tǒng)計學方法：應用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，獨立樣本t檢驗比較兩組均值。Spearman等級相關系數(shù)評價MTH1基因mRNA 和蛋白表達的相關性。Log-ranktest比較兩組總的生存率 (overall survival, OS)。COX比例回歸風險模型明確CRC臨床病理參數(shù)和MTH1蛋白表達對CRC患者生存率和預后的影響，所有參數(shù)先進行單因素分析，具有顯著意義的參數(shù)再進行多因素分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1.結腸癌組織中MTH1蛋白的表達：免疫組化結果顯示，癌旁正常組織MTH1蛋白免疫染色強度很弱，腫瘤組織染色呈現(xiàn)輕、中、重不同程度的分級(圖1)。87例癌組織中高表達54例，低表達33例。應用log-rank檢驗比較MTH1高表達組和低表達組的生存率，結果顯示MTH1高表達組生存率更低(P=0.005)。應用COX比例風險回歸模型對臨床資料和MTH1進行多因素統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，MTH1表達量是患者預后的影響因素(HR=2.256,95% CI:1.008～5.049,P=0.048)。

圖1 結直腸癌組織芯片MTH1染色代表性圖片(×200)A.癌旁正常組織；B～D.不同染色程度的結腸癌組織

2.結腸癌細胞株中MTH1基因mRNA和蛋白質的表達：如圖2B所示，腫瘤細胞中MTH1基因mRNA表達量高于正常的腸上皮細胞。獨立樣本t檢驗分析表明腫瘤細胞中MTH1基因mRNA表達顯著增加(P<0.05)。Western blot法檢測結果表明腫瘤細胞中MTH1蛋白表達同樣顯著高于正常腸上皮細胞(獨立樣本t檢驗，P<0.05，圖2中A、C)。Spearman相關性分析結果顯示這些細胞株中MTH1基因mRNA表達水平與蛋白表達水平具有顯著相關性(P=0.000)，表明MTH1基因表達主要在轉錄水平進行調節(jié)。

圖2 結腸癌細胞株中MTH1基因mRNA和蛋白的表達A.Western blot法檢測細胞株中MTH蛋白表達水平；B.實時熒光定量PCR檢測細胞株中MTH1基因mRNA表達水平；C.MTH1蛋白相對定量結果;與CCC-HIE-2比較，*P<0.05

3.細胞增殖實驗：瞬時敲減后HCT116和LoVo細胞中MTH1蛋白表達水平明顯下降(圖3A)。CCK實驗表明MTH1低表達導致HCT116和LoVo細胞活力顯著下降，細胞增殖能力下降(P<0.05，圖3中B、C)。

圖3 CCK檢測siMTH1敲減后HCT116和LoVo細胞活力A.Western blot法驗證細胞株敲減效果；B、C. siMTH1組和對照組細胞增殖曲線；與siCtrl比較，*P<0.05

4.細胞侵襲及遷移實驗：在顯微鏡下觀察和計數(shù)Transwell小室外側底部細胞(圖4)，與對照組細胞比較，HCT116和LoVo細胞敲低MTH1后，小室外側底部細胞明顯減少。獨立樣本t檢驗分析表明敲減MTH1后，結腸癌細胞的遷移和侵襲能力顯著下降(P<0.05,圖5)。

圖4 siMTH1敲減后HCT116和LoVo細胞遷移和侵襲能力代表性結晶紫染色圖(×40)

圖5 Transwell檢測siMTH1敲減后HCT116和LoVo細胞遷移和侵襲能力A.siMTH1組和對照組的HCT116細胞每200倍視野下細胞數(shù)；B.siMTH1組和對照組的LoVo細胞每200倍視野下細胞數(shù);與siCtrl比較，*P<0.05

討 論

1992年關口睦夫等發(fā)現(xiàn) MutT蛋白可以降解DNA合成時一種致突變的底物8-oxo-dGTP阻止復制錯誤[6]。1997年關口睦夫等與法國M.Radman教授合作，證明了大腸桿菌MutT蛋白不僅可以分解核苷酸池中引起8-oxo-dGTP，也可以分解核苷酸池中8-oxoGTP，從而阻止這一變異原性物質在轉錄水平結合到RNA上[7]。與大腸桿菌比較，哺乳動物細胞中擁有更為精密機制參與核苷酸池中氧化核苷酸的清除，這一類蛋白命名為Nudix水解酶或MutT同源蛋白。目前研究最多是MTH1蛋白，很多腫瘤組織的發(fā)生、發(fā)展過程中均出現(xiàn)了MTH1蛋白的異常表達，例如大腸癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌等腫瘤組織中MTH1 mRNA或蛋白的表達量明顯高于癌旁組織或正常組織[8，9，11～13]。

本研究發(fā)現(xiàn)結腸癌細胞株和結腸癌組織中MTH1表達量顯著增加，MTH1高表達患者總的生存率降低，MTH1高表達是患者低生存率的獨立預測因素。更重要的是，進一步研究證明MTH1低表達導致HCT116和LoVo細胞活力、遷移和侵襲能力下降，提示MTH1高表達對癌細胞的生長和侵襲發(fā)揮重要作用。

早期研究發(fā)現(xiàn)，在MutT缺陷大腸桿菌中表達 MTH1基因的cDNA 可顯著降低大腸桿菌自發(fā)突變率以及變異蛋白質的產生；在哺乳動物293T細胞中敲減 MTH1后加入外源性8-oxo-dGTP增加了 A:T 到 C:G顛換突變[14]。近年來，Thomas Helleday等將MTH1小干擾RNA分別導入腫瘤細胞和正常細胞，發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞DNA損傷增加和存活率降低，而正常細胞無明顯變化[15]。筆者所在實驗室前期研究證明在結直腸癌組織中DNA和RNA氧化水平顯著高于癌旁組織。本研究顯示AJCC分期Ⅲ+Ⅳ期的結腸癌中MTH1表達高者更多，有淋巴結轉移的結腸癌中MTH1表達高者更多；敲低MTH1可導致結腸癌細胞生長、遷移和侵襲能力下降；MTH1高表達的患者生存率下降。考慮到腫瘤中氧化還原失衡、ROS增加以及DNA和RNA氧化增加，MTH1蛋白表達上調可以維持氧化應激下DNA復制和轉錄的保真性，有利于腫瘤的生長和轉移，進而縮短腫瘤患者的生存期。另外，RAS致癌基因與腫瘤的增殖、侵襲、遷移、血管生成等惡性特征有關[16]。人非小細胞肺癌中，MTH1 mRNA表達水平與KRAS突變及表達相關，提示MTH1可以通過調節(jié)RAS通路影響腫瘤的惡性程度[17]。

腫瘤靶向治療有利于提高患者生存率，改善患者預后。2014年瑞典科學家Thomas Helleday等將MTH1小干擾RNAs分別導入腫瘤細胞和正常細胞，發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞存活率降低，而正常細胞無明顯變化，他們用MTH1抑制劑TH287和TH588的研究進一步證明了在腫瘤細胞中抑制MTH1的表達可選擇性地殺死腫瘤細胞。此外，黑色素瘤、SW480結直腸癌和MCF7乳腺癌的裸鼠移植實驗也對TH588的處理產生了療效[15]。因此，MTH1被認為是一種新的抗腫瘤靶點。通過本研究筆者證明了干擾MTH1表達，不僅抑制結腸癌細胞增殖，還影響了癌細胞的遷移和侵襲能力。

綜上所述，MTH1蛋白在結腸癌組織中表達上調，其表達量與腫瘤的進展和患者的預后有關。MTH1蛋白在其他腫瘤中的分子機制研究還需要進一步的實驗加以證明。