周曉芳 劉 楊 侯秀秀 趙智翔 許敏達

喉癌是耳鼻喉科常見的惡性腫瘤之一，在頭、頸部上皮來源的原發(fā)惡性腫瘤中排名第2位，其中男性的發(fā)生率約為女性的10倍，且發(fā)生率呈逐年增高的趨勢[1]。近年來，激光治療在早期喉癌中雖然起到較好的治療效果，但對于患者的5年生存率并無明顯改善。目前對于中、晚期喉癌的治療仍以手術(shù)為主聯(lián)合放射治療和化學(xué)治療的綜合治療，然而手術(shù)造成的患者術(shù)后呼吸、發(fā)聲困難等相關(guān)后遺癥，特別是晚期喉癌患者，廣泛的喉部器官切除嚴重影響了患者的生活質(zhì)量，為了更好的改善喉癌患者的診療和預(yù)后，從喉癌的生物學(xué)特性深入研究，尋找治療的新靶點，可能成為提高喉癌治療效果及改善患者生存質(zhì)量的關(guān)鍵[2]。

作為膜聯(lián)蛋白家族重要成員之一的膜聯(lián)蛋白A5(annexin A5，ANEX5)，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用,通過多種途徑調(diào)控腫瘤細胞的生物學(xué)活性[3]。Zhao等[4]證實喉癌組織中annexin A5表達較癌旁正常組織明顯上調(diào)，且與喉癌的臨床分期、病理學(xué)分級及頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。筆者前期體外細胞實驗研究發(fā)現(xiàn)，有效阻低annexin A5的表達后，喉癌細胞凋亡減弱，因此筆者推斷annexin A5可能促進喉癌細胞的凋亡[5]。本研究采用RNA干擾技術(shù)體外沉默annexin A5基因在喉癌細胞中的表達，以進一步探討阻低annexin A5基因前后對喉癌Hep-2細胞增殖和侵襲的影響，為喉癌的基因治療提供可能的依據(jù)。

材料與方法

1.材料：人喉癌細胞 Hep-2購自上海生物科學(xué)研究院細胞總庫，細胞培養(yǎng)基RPMI-1640購自美國HyClone公司,LipofectamineTM2000 及Trizol購自美國Invitrogen公司，青霉素、鏈霉素、小牛血清購自美國Gibco公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、taq酶購自日本TaKaRa公司,annexin A5單克隆抗體、β-actin單克隆抗體、二抗辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase)，HRP購自美國Epitmics公司，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、Fibronectin購自美國Millipore公司，CCK-8 kit、蛋白裂解液、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購自中國碧云天公司，陰性對照siRNA和annexin A5-siRNA購自日本TaKaRa公司，Matrigel購自美國BD公司。

2.用siDirect Version2.0設(shè)計annexin A5基因的特異性siRNA序列：通過Pubmed比對及前期實驗證實有效的特異性RNA序列，并由大連寶生物公司合成。特異性siRNA序列為：上游引物：5′-CCAUGAUACUUUAAUCAGAAG-3′，下游引物：5′-UCUGAUUAAAGUAUCAUGGTT-3′；無關(guān)siRNA片段的上游引物：5′-AGGUGACUAGCACUGUUAGTT-3′，下游引物：5′-GUAACAGUGCUAGUCACCUTT-3′。

3.細胞培養(yǎng):Hep-2細胞從液氮中復(fù)蘇，低速離心后去除凍存液，將Hep-2細胞培養(yǎng)于含10%小牛血清和1%青鏈霉素的1640培養(yǎng)基中， 5%CO2孵箱、37℃，48～72h傳代或換液。

4.細胞轉(zhuǎn)染：將對數(shù)生長的Hep-2細胞以2 ×105/孔接種到6孔板中，培養(yǎng)24h后參照脂質(zhì)體(LipofectamineTM2000)說明書進行細胞轉(zhuǎn)染，siRNA濃度為50ng/L。實驗分成siRNA干擾組(含annexin A5-siRNA干擾片段及脂質(zhì)體)、空白對照組(僅含脂質(zhì)體)及陰性對照組(含無關(guān)序列siRNA片段和脂質(zhì)體)3組，轉(zhuǎn)染液為RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染6h后換常規(guī)細胞培養(yǎng)基。

5.半定量實時PCR:細胞轉(zhuǎn)染后48h，用Trizol試劑提取Hep-2細胞的總RNA，檢測合格后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并用半定量PCR技術(shù)擴增膜聯(lián)蛋白A5基因，引物序列為：annexin A5(342bp)：上游引物：5′-TCTCGGCTTTATGATGCTTATG-3′，下游引物：5′-TCGTGTTCCAAAGATGGTGAT-3′；β-actin(594bp)：上游引物：5-GACCCAGATCATGTTTGAGACC-3′，下游引物：5′-ATCTCCTTCTGCATCCTGTCG-3′；將PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，嗅化乙錠染色，將成像系統(tǒng)采集的圖片通過PDQuest軟件分析比對，β-actin做內(nèi)參，實驗重復(fù)3次。

6.Western blot法檢測：將轉(zhuǎn)染48h后的Hep-2細胞進行總蛋白提取，BCA蛋白定量后進行蛋白質(zhì)電泳，根據(jù)蛋白質(zhì)分子量選擇相應(yīng)的SDS-PAGE凝膠，去30μg總蛋白上樣濃縮膠，80V恒壓電泳至樣品進入分離膠，改120V繼續(xù)恒壓電泳，當指示劑遷移至分離膠下游邊緣時停止電泳，200mA恒流轉(zhuǎn)膜40min后用封閉液封閉1h，4℃孵育annexin A5抗體過夜，用二抗IgG 室溫振蕩孵育1h后，洗滌液洗膜3次，ECL試劑盒法顯色，Bio-Rad成像系統(tǒng)成像，并用該系統(tǒng)對圖像進行分析，β-actin為內(nèi)參，實驗均重復(fù)3次。

7.CCK-8檢測細胞增殖：將對數(shù)生長的Hep-2細胞接種于96孔板中，細胞濃度為1×104/孔，細胞鋪滿96孔板50%時進行細胞轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染siRNA終濃度50nmol/L，總體積為100微升/孔。細胞轉(zhuǎn)染24、48、72h分別加入CCK8試劑，37℃CO2孵箱中培育1h，酶標儀測定波長450nm的細胞吸光度，分析細胞增長情況。

8.Transwell小室侵襲實驗：50mg/L的Matrigel膠稀釋4倍后包被Transwell小室上室面，小室的下室面用10mg/L的Fibronectin均勻涂抹，37℃孵育1h；將培養(yǎng)板中殘余液體吸出，小室內(nèi)每孔加入10g/L的BSA無血清培養(yǎng)液50μl，37℃孵育30min，然后將小室置于24孔板中，小室外加入常規(guī)1640培養(yǎng)基(含雙抗及10%小牛血清)600μl，將轉(zhuǎn)染48h的He-2細胞以1×105/200μl的濃度加入到小室內(nèi)，37℃、CO2孵箱中培養(yǎng)24h后取出小室，并用棉簽仔細擦除微孔膜上層的細胞，將微孔膜下層的細胞用10%結(jié)晶紫進行染色，剪下微孔膜并固定載玻片上于在高倍顯微鏡下觀察計算細胞數(shù)，每個樣本各個方位隨機計數(shù)10個高倍視野(200倍),每組實驗重復(fù)3次。

結(jié) 果

1.siRNA干擾組能抑制annexin A5 mRNA的表達：如圖1所示，轉(zhuǎn)染48h后，siRNA干擾組中annexin A5基因mRNA相對表達水平為0.197±0.013，空白對照組為0.712±0.037，陰性對照組為0.674±0.063。結(jié)果提示siRNA干擾組annexin A5 mRNA表達較陰性對照組及空白對照組明顯下降(F=134.484,P<0.05)，陰性對照組和空白對照組mRNA表達比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

圖1 實時PCR檢測各組annexin A5 mRNA表達結(jié)果

2.siRNA干擾組能抑制annexin A5蛋白的表達：如圖2所示，轉(zhuǎn)染48h后，siRNA干擾組膜聯(lián)蛋白 A5蛋白相對表達水平為0.449±0.064；而空白對照組為0.949±0.074；陰性對照組為1.001±0.107。結(jié)果提示siRNA干擾組蛋白明顯下降，空白對照組和陰性對照組比較， 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=39.849,P<0.05)， 空白對照組和陰性對照組蛋白表達比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

圖2 Western blot法檢測各組annexin A5蛋白表達結(jié)果

3.siRNA干擾組能抑制Hep-2細胞的增殖：如圖3、表1所示，轉(zhuǎn)染24h后，siRNA干擾組對比空白對照組和陰性對照組，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，轉(zhuǎn)染48、72h后，siRNA干擾組細胞增殖低于空白對照組和陰性對照組，而空白對照組、陰性對照組細胞增殖比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖3 CCK-8法檢測Hep-2細胞增殖曲線

表1 CCK-8檢測細胞A值

分組24h48h72hsiRNA干擾組0.315±0.0020.607±0.0040.695±0.017陰性對照組0.311±0.0050.743±0.0240.942±0.008空白對照組0.315±0.0030.759±0.0180.962±0.008F1.73891.561636.374P0.2170.0000.000

4.siRNA干擾組能抑制Hep-2細胞的侵襲能力：Transwell小室實驗結(jié)果如圖4所示：空白對照組、陰性對照組細胞數(shù)分別為62.333±6.994和61.433±5.328，而siRNA干擾組為22.467±3.980個，siRNA干據(jù)組明顯低于空白對照組及陰性對照組(F=500.546,P<0.05)，而空白對照組和陰性對照組細胞數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，沉默annexin A5基因的表達能夠在體外抑制喉癌Hep-2細胞的侵襲能力。

圖4 各組喉癌Hep-2細胞侵襲情況(結(jié)晶紫染色，×200)A.空白對照組；B.陰性對照組；C.siRNA干擾組

討 論

annexins是通過鈣離子調(diào)節(jié)的多功能蛋白家族,在細胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、鈣離子通道形成、炎性反應(yīng)、腫瘤的增殖與分化、細胞骨架蛋白間的相互作用以及維持細胞外基質(zhì)的完整性等方面具有重要作用[6]。annexin A5是膜聯(lián)蛋白家族中分布最廣泛、含量最豐富的成員之一，位于人染色體4q26～q28，由319個氨基酸組成，常以Ca2+依賴的形式與膜磷脂結(jié)合，參與一系列的細胞生物學(xué)過程[7]。近年來對annexin A5蛋白的研究備受關(guān)注，研究發(fā)現(xiàn)在多種惡性腫瘤中存在異常表達，并通過多種途徑調(diào)控腫瘤細胞的增殖和浸潤轉(zhuǎn)移[8～12]。研究發(fā)現(xiàn)，在頭頸部鱗狀上皮來源的惡性腫瘤中膜聯(lián)蛋白A5表達明顯上調(diào),且其表達與腫瘤的惡性程度、侵襲轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)[13]。

本研究通過化學(xué)合成的siRNA對annexin A5基因進行表達沉默。RNA干擾(RNA interference，RNAi)是一種已被證實能有效沉默目的基因表達的常見基因沉默的技術(shù)。通過實時PCR及Western blot法分別從mRNA水平和蛋白水平驗證siRNA對annexin A5基因干擾效果。圖1、圖2顯示，PDQuest軟件分析后顯示特異性的siRNA片段能有效干擾annexin A5基因mRNA和蛋白在喉癌細胞中的表達。通過CCK-8試劑盒檢測法及Transwell小室侵襲實驗發(fā)現(xiàn)，有效阻低annexin A5基因的表達后，喉癌細胞增殖、侵襲能力均明顯減弱，結(jié)果提示annexin A5可能促進腫瘤的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移。

前期研究發(fā)現(xiàn)，annexin A5低表達抑制喉癌細胞的凋亡，同時又在喉癌晚期及伴淋巴轉(zhuǎn)移的癌組織中表達較早期喉癌表達明顯增高[4]。然而，干擾annexin A5在喉癌細胞中的表達后，喉癌細胞凋亡抑制，同時增殖和侵襲能力也減弱，即在同一種腫瘤細胞中，兼具促瘤和抑瘤作用。這可能與annexin A5參與細胞的炎性致癌相關(guān)，即annexin A5可能通過介導(dǎo)癌細胞凋亡而促使免疫反應(yīng)發(fā)生，使低致瘤、低轉(zhuǎn)移的腫瘤細胞通過接觸早期炎性細胞而轉(zhuǎn)換成高致瘤、轉(zhuǎn)移性的腫瘤細胞[3]。此外研究發(fā)現(xiàn)，在調(diào)控腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中膜聯(lián)蛋白 A5起著重要作用，且在不同腫瘤細胞中annexin A5同時兼具促瘤和抑瘤作用[3，14]。Peng等[15]發(fā)現(xiàn)過表達annexin A5能夠增加小鼠肝癌細胞株的體外侵襲和轉(zhuǎn)移，且其表達水平與小鼠肝臟腫瘤的惡性程度及淋巴轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，提示膜聯(lián)蛋白A5具有促瘤作用。Wang等[8]研究發(fā)現(xiàn)在宮頸癌細胞中annexin A5表達阻低后可能通過影響 E-cadherin和 MMP-9的表達來促進HeLa細胞的遷移和侵襲，提示膜聯(lián)蛋白A5具有抑癌作用。Sun等[16]發(fā)現(xiàn)在肺癌細胞中annexin A5通過調(diào)節(jié)多種細胞信號通路影響肺癌的發(fā)生、發(fā)展。Wu等[17]也發(fā)現(xiàn)在胃癌中上調(diào)annexin A5的表達能激活多藥耐藥相關(guān)蛋白(multidrug resistance-associated protein，MRP)，而影響胃癌的預(yù)后。通過研究發(fā)現(xiàn)在不同腫瘤細胞中干擾annexin A5后對細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響并不一致。因此筆者推測，在喉癌細胞中annexin A5也可能通過影響某些腫瘤相關(guān)基因的表達或通過調(diào)節(jié)多種細胞信號通路來促進喉癌細胞的侵襲能力。

另外，有研究發(fā)現(xiàn)annexin A5 的酸性磷脂是其參與細胞內(nèi)外重要功能的關(guān)鍵。annexin A5的酸性磷脂位于一個由4個相同區(qū)域構(gòu)成的高度保守核心內(nèi),其中的蛋白核心都被折疊成5α螺旋后反轉(zhuǎn)纏繞成右手超螺旋，其氨基酸特殊的排列順序從而形成了annexin A5功能多樣性的特點[18]。因此推斷阻低annexin A5在喉癌Hep-2細胞中的表達阻低后，還可能引起部分annexin A5異常的磷酸化或在細胞內(nèi)表達異位，從而使喉癌Hep-2細胞的生物學(xué)活性發(fā)生一定改變；或通過annexin A5介導(dǎo)Ca2+流動異常而影響腫瘤細胞的發(fā)生和發(fā)展[19]。

綜上所述，喉癌的發(fā)生、發(fā)展是多種因素影響的復(fù)雜過程，本研究發(fā)現(xiàn)，通過體外改變annexin A5在喉癌Hep-2細胞中的表達，能一定程度影響Hep-2喉癌細胞的增殖與侵襲能力,提示annexin A5可能在喉癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮促癌作用，有望成為喉癌早期診斷和預(yù)后判斷的參考指標，但是annexin A5在喉癌中的作用及相關(guān)分子機制仍有待于深入研究。