薛 麗 伊雪梅 張 婧 黨雅梅 趙鳳輝 李紅玲

經(jīng)典型霍奇金淋巴瘤(classical Hodgkin′s lymphoma, cHL) 是一種起源于淋巴造血系統(tǒng)的惡性腫瘤，占所有霍奇金淋巴瘤的95%，好發(fā)于青年及老年人[1]。cHL患者的預(yù)后較好，70%～80%的患者經(jīng)過規(guī)范化治療可達(dá)到5年的生存率，但仍有5%～10%的患者會(huì)出現(xiàn)耐藥，10%～30%的患者會(huì)出現(xiàn)緩解后復(fù)發(fā)，從而表現(xiàn)為復(fù)發(fā)難治和較差的預(yù)后[2, 3]。氧化應(yīng)激是由活性氧(reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生與細(xì)胞抗氧化能力之間失衡而導(dǎo)致機(jī)體處于的病理狀態(tài)。研究表明，氧化應(yīng)激與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有一定的相關(guān)性[4]。相對(duì)高濃度的ROS的細(xì)胞內(nèi)積累可誘導(dǎo)DNA的氧化損傷，這可能參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，與氧化應(yīng)激相關(guān)的凋亡信號(hào)途徑的有關(guān)基因很可能會(huì)對(duì)腫瘤的治療提供參考。核因子E2相關(guān)因子(nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2)屬于 Cap-n-collar (CNC)家族，是具有堿性亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，廣泛存在于機(jī)體各個(gè)器官，是細(xì)胞對(duì)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的主控調(diào)節(jié)因子[5]。正常情況下，Nrf2的活化可預(yù)防心血管疾病、肺纖維化、糖尿病、衰老、神經(jīng)退行性疾病、腫瘤等的發(fā)生[6]。血紅素氧合酶-1 (heme oxygenase-1，HO-1)是一種誘導(dǎo)性微粒體催化酶，具有抗炎、抗氧化、抗細(xì)胞凋亡等作用[7]。然而，許多研究表明，Nrf2和HO-1在許多人類腫瘤中異常高表達(dá)，且其高表達(dá)與腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移、化學(xué)抗性等生物學(xué)行為有關(guān)[8]。本研究通過SP免疫組化法檢測(cè)Nrf2和HO-1在cHL組織中的表達(dá)，初步探討Nrf2和HO-1在cHL發(fā)生、發(fā)展中可能發(fā)揮的作用。

材料與方法

1.臨床資料:收集2012年1月～2017年12月由筆者醫(yī)院確診的42例初發(fā)cHL患者的資料和標(biāo)本，其中男性27例，女性15例；患者年齡5～78歲，中位年齡39.5歲。所有患者經(jīng)病理及免疫組化確診為cHL。其診斷及分類標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)WHO 2016年版《淋巴造血系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)》，結(jié)節(jié)硬化性19例，混合型16例，淋巴細(xì)胞豐富性7例。所有患者臨床資料完整。并收集同期診治的23例淋巴結(jié)反應(yīng)增生患者作為對(duì)照組，患者年齡9～67歲，中位年齡42歲。本研究經(jīng)筆者醫(yī)院倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)，患者知情同意。

2.免疫組化：兔抗人Nrf2多克隆抗體(rabbit anti-Nrf2 antibody，ab137550)和兔抗人HO-1多克隆抗體(rabbit anti-HO-1 antibody，ab13243)購自英國Abcam 公司；免疫組化SP試劑盒購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。所有標(biāo)本均經(jīng)10%甲醛緩沖液固定，常規(guī)石蠟包埋，制作4μm切片，行免疫組化染色。SP免疫組化法嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行操作。Nrf2和HO-1工作濃度均為1∶100。所有切片采用檸檬酸緩沖液煮沸進(jìn)行修復(fù)抗原，以 PBS 代替一抗作為陰性對(duì)照。

3.結(jié)果判定：采用雙評(píng)分半定量法進(jìn)行評(píng)分，在每張載玻片上隨機(jī)選取5個(gè)視野，并且在每個(gè)高倍視野(×400)下計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞。根據(jù)染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞的百分比2種計(jì)分方式進(jìn)行綜合評(píng)分。結(jié)果判定由筆者醫(yī)院兩位資深病理學(xué)專家進(jìn)行雙盲法評(píng)估。Nrf2 和HO-1的陽性表達(dá)均主要見于細(xì)胞核內(nèi)，呈黃色、棕黃色或棕褐色顆粒。依據(jù)陽性細(xì)胞百分比：≤5%計(jì)為0分，6%～25% 計(jì)為1分，26%～50% 計(jì)為2分，≥51% 計(jì)為3分。依據(jù)染色強(qiáng)度：無染色計(jì)為0分，弱染色計(jì)為1分，中等染色計(jì)為2分，強(qiáng)染色計(jì)為3分。將兩個(gè)分?jǐn)?shù)相乘即染色指數(shù)得最終診斷標(biāo)準(zhǔn): 0 分為(-)，1～9分為陽性，其中1～3分為弱陽性(+)，4～6分為中等陽性(++)，7～9分為強(qiáng)陽性(+++)。本實(shí)驗(yàn)以+～+++為陽性表達(dá)。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：應(yīng)用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。組間比較采用χ2檢驗(yàn)[n≥40，且所有理論頻數(shù)(T)≥5]或連續(xù)校正χ2檢驗(yàn)(n≥40，但有1≤T<5)。Nrf2和HO-1表達(dá)水平的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)性分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.Nrf2在cHL及淋巴結(jié)反應(yīng)增生組織中的的表達(dá):Nrf2的陽性表達(dá)主要見于細(xì)胞核中，呈棕黃色或棕褐色顆粒。Nrf2在cHL和淋巴結(jié)反應(yīng)增生組織中的陽性表達(dá)分別為 42.9%和13.0%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1，圖1) 。

表1 Nrf2、HO-1在cHL和淋巴結(jié)反應(yīng)增生組織中的表達(dá) [n(%)]

圖1 Nrf2在cHL組織中的表達(dá)(SP，×400)A.Nrf2表達(dá)呈陰性(-);B.Nrf2表達(dá)呈弱陽性(+);C.Nrf2表達(dá)呈中等陽性(++);D.Nrf2表達(dá)呈強(qiáng)陽性(+++)

2.HO-1在cHL及淋巴結(jié)反應(yīng)增生組織中的的表達(dá):HO-1的陽性表達(dá)主要見于細(xì)胞核中，呈棕黃色或棕褐色顆粒。HO-1在cHL和淋巴結(jié)反應(yīng)增生組織中的陽性表達(dá)分別為 47.6%和17.4%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1，圖2)。

圖2 HO-1在cHL組織中的表達(dá)(SP,×400)A.HO-1表達(dá)呈陰性(-);B.HO-1表達(dá)呈弱陽性(+);C.HO-1表達(dá)呈中等陽性(++);D.HO-1表達(dá)呈強(qiáng)陽性(+++)

3.Nrf2、HO-1的表達(dá)與cHL臨床病理特征的關(guān)系:Nrf2、 HO-1在cHL組織中的表達(dá)均與患者性別，年齡，LDH，病理分型無關(guān)(P>0.05)，而與Ann Arbor stage臨床分期，B癥狀有關(guān)(P<0.05)。臨床分期 Ⅲ～Ⅳ期患者Nrf2、HO-1陽性表達(dá)(分別為61.5%和65.4%)高于Ⅰ～Ⅱ期患者(分別為12.5%和18.8%)；Nrf2、HO-1在有B癥狀患者中的陽性表達(dá)(分別為62.5%和75.0%)高于無B癥狀患者(分別為16.7%和11.1%),詳見表2。

表2 Nrf2、HO-1的表達(dá)與cHL臨床病理特征的關(guān)系 [n(%)]

4.Nrf2與HO-1在cHL組織中表達(dá)的相關(guān)性：在cHL組織中，Nrf2 與HO-1 蛋白的表達(dá)呈正相關(guān) (r=0.619，P<0.05，表3)。

表3 Nrf2、HO-1在cHL中表達(dá)的相關(guān)性分析 (n)

討 論

Nrf2是調(diào)控細(xì)胞對(duì)抗異源性物質(zhì)和氧化損傷的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。Nrf2的活性主要由Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1(Kelch-1ike ECH-associated protein l，Keap1)負(fù)性調(diào)節(jié)，生理狀態(tài)下，Nrf2 與Keap1偶聯(lián)并與胞質(zhì)肌動(dòng)蛋白結(jié)合被錨定在胞質(zhì)，從而促進(jìn)Nrf2被泛素蛋白酶體 (Cul3 E3) 降解，導(dǎo)致Nrf2的表達(dá)量維持在較低水平以維持基本轉(zhuǎn)錄。當(dāng)機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，Nrf2與Keap1解偶聯(lián)并轉(zhuǎn)移入核，與Maf蛋白結(jié)合成異二聚體后識(shí)別并與抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element，ARE)結(jié)合，從而激活多種抗氧化基因和解毒基因的轉(zhuǎn)錄，包括HO-1，作為細(xì)胞對(duì)氧化損傷的一種保護(hù)性反應(yīng)[9]。因此，傳統(tǒng)上Nrf2一直被認(rèn)為是介導(dǎo)細(xì)胞防御反應(yīng)的重要因子，協(xié)助抵抗氧化應(yīng)激損傷，保護(hù)細(xì)胞免受化學(xué)物質(zhì)的損害，成為化學(xué)預(yù)防研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。然而，越來越多的研究表明，Nrf2不僅可以保護(hù)正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化為腫瘤細(xì)胞，而且還可以保護(hù)腫瘤細(xì)胞免受氧化應(yīng)激以及放化療損傷，從而有助于腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[10]。文獻(xiàn)報(bào)道，Nrf2在多種人類腫瘤如胃癌、卵巢癌、胰腺癌等中表達(dá)均上調(diào)，它的持續(xù)異?；罨c腫瘤進(jìn)展，侵襲轉(zhuǎn)移以及放療、化療抗性有關(guān)[11～13]。迄今為止，Nrf2在cHL組織中的表達(dá)及意義尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。

HO-1被認(rèn)為是Nrf2下游細(xì)胞應(yīng)答的主要效應(yīng)物之一，它是血紅素代謝的限速酶，能將血紅素降解為膽紅素、一氧化碳(CO)和鐵離子(Fe2+)，三者均在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用[14]。它是一種在多數(shù)哺乳動(dòng)物組織中以低水平存在的應(yīng)激蛋白，其表達(dá)由多種刺激誘導(dǎo)，包括缺氧、重金屬、內(nèi)毒素、細(xì)胞因子、血紅素、一氧化氮及紫外線照射[15]。HO-1及其代謝產(chǎn)物在保護(hù)健康細(xì)胞及細(xì)胞應(yīng)激的適應(yīng)性反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，因其可通過抵抗ROS介導(dǎo)的致癌作用來預(yù)防它們轉(zhuǎn)化為惡性細(xì)胞[16]。然而，HO-1被發(fā)現(xiàn)在人類多種腫瘤中高表達(dá)并與生物學(xué)行為密切相關(guān)。Tsai等[17]發(fā)現(xiàn)HO-1高表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌的侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。Noh等[18]發(fā)現(xiàn)HO-1對(duì)乳腺癌的預(yù)后具有指導(dǎo)意義。Huang等[19]發(fā)現(xiàn)HO-1上調(diào)抑制了彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞凋亡。Mayerhofer等[20]發(fā)現(xiàn)在慢性粒細(xì)胞白血病中HO-1與伊馬替尼耐藥有關(guān)。Cerny-Reiterer等[21]發(fā)現(xiàn)HO-1是急性淋巴細(xì)胞白血病中必不可少的生存因子和潛在的新靶標(biāo)。目前，HO-1在cHL組織中的臨床價(jià)值尚缺乏相關(guān)研究。

本研究通過免疫組化法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Nrf2和HO-1在cHL組織中均呈高表達(dá)，且染色反應(yīng)主要定位于細(xì)胞核內(nèi)，這一結(jié)果與兩者在其他許多惡性腫瘤中的表達(dá)基本一致，這可能對(duì)cHL的臨床治療具有一定指導(dǎo)意義。此外，筆者還分析了Nrf2和HO-1表達(dá)與臨床病理特征間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)隨著cHL臨床分期越晚，Nrf2和HO-1的表達(dá)越高(Ⅲ～Ⅳ期患者高于Ⅰ～Ⅱ期)；同時(shí)發(fā)現(xiàn)兩者在有B癥狀cHL患者中的表達(dá)高于無B癥狀者，目前有研究已明確表明B癥狀與霍奇金淋巴瘤的不良預(yù)后有關(guān)，這些結(jié)果表明Nrf2和HO-1的表達(dá)可能與cHL的進(jìn)展有關(guān)。而且，筆者還發(fā)現(xiàn)Nrf2與HO-1在cHL組織中的表達(dá)呈正相關(guān)，這表明Nrf2/HO-1信號(hào)通路對(duì)cHL的發(fā)生、發(fā)展具有重要的生物學(xué)作用，Nrf2可能對(duì) HO-1 的生成起到正向調(diào)節(jié)作用,兩者具有協(xié)同作用，其可能歸因于惡性轉(zhuǎn)化過程中細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)和自我保護(hù)作用。然而，由于本研究未對(duì)以上患者進(jìn)行隨訪，中位生存期未知，因此Nrf2和HO-1是否與cHL患者的不良預(yù)后有關(guān)有待深入研究。而且，本研究樣本量相對(duì)較小，具有一定的局限性，確切的分子機(jī)制需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究通過探討Nrf2和HO-1在cHL中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)兩者在cHL的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。通過Nrf2/HO-1通路抗腫瘤作用值得深入研究,如Nrf2和HO-1基因可能為藥物治療提供新途徑?？傊?，Nrf2/HO-1通路有望為腫瘤的分子治療提供新的臨床思路。