葛俊文 李紅梅 張儒舫 沈 立

體外循環(huán)(cardiopulmonary bypass,CPB)下心臟手術(shù)創(chuàng)傷較大，且難以避免地會(huì)誘發(fā)腦缺血再灌注損傷，造成嚴(yán)重的早期或晚期中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者預(yù)后[1]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類進(jìn)化上高度保守的單鏈非編碼小分子RNA，由21～25個(gè)核苷酸組成，miRNA與靶基因mRNA分子的3′端非編碼區(qū)域(3′-UTR)互補(bǔ)配對(duì)后，通過降低mRNA分子穩(wěn)定性和翻譯抑制參與靶基因表達(dá)調(diào)控[2]。其中miRNA-200家族包含5個(gè)成員，分成兩組：①miR-200a、miR-200b以及miR-429;②miR-200c和miR-141[3]。miR-200家族在胚胎和神經(jīng)發(fā)育中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[4]。

外泌體(exosomes，Exo)是由細(xì)胞內(nèi)多泡體與細(xì)胞膜融合后，釋放到細(xì)胞外基質(zhì)中的一種直徑約40～150nm的膜性囊泡[5]。神經(jīng)干細(xì)胞/祖細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞等大多數(shù)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞均可形成及分泌外泌體[6]。外泌體完善了中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞之間的交流網(wǎng)絡(luò)。大量的研究表明外泌體及內(nèi)含的miRNA在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，可為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的診斷和治療提供參考價(jià)值[7, 8]。本研究中，筆者通過構(gòu)建原代海馬細(xì)胞糖氧剝奪再灌注(oxygen-glucose deprivation/reperfusion，OGD/R)模型，探究外泌體miR-200家族成員對(duì)OGD/R腦損傷的影響。

材料與方法

1.材料：(1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)。(2)主要試劑與材料：FBS、DMEM培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)；BSA、1% Triton x-100、Hoechst33258(中國碧云天公司，C1011)；二甲基亞砜(DMSO)、Trizol試劑(美國Invitrogen公司)、Total Exosome Isolation(美國Invitrogen公司，4478359)、BCA蛋白定量試劑盒(中國Biosharp公司，BL521A)；SYBRGreen PCR試劑盒 (美國Thermo公司，F(xiàn)-415XL)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Thermo公司，#K1622)；噻唑藍(lán)(美國Sigma公司)、活性氧檢測試劑盒(中國碧云天公司，S0063)、Annexin V-FITC/PI試劑盒(美國BD 公司，556547)，pvdf膜(美國millipore公司，HATF00010)。

2.方法：(1)原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞分離培養(yǎng)：參照文獻(xiàn)[9]原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元并進(jìn)行鑒定。新生SD大鼠，75%乙醇浸泡5min,無菌解剖，小心分離暴露海馬區(qū)，以0.25%胰蛋白酶 37℃水浴消化15min。待組織塊沉淀后吸取上清液至另外一個(gè)5ml離心管，1500r/min離心3min，將細(xì)胞接種至多聚賴氨酸包被的6cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，按時(shí)半量更換培養(yǎng)液。(2)OGD/R模型：神經(jīng)元細(xì)胞鋪板培養(yǎng)好后，用PBS 洗滌細(xì)胞，換入新鮮glucose-free DMEM，參照文獻(xiàn)[10]，以5% CO2、95% N2、37℃缺氧孵育2h，然后將培養(yǎng)基換為無外泌體的完全培養(yǎng)基，常溫常氧培養(yǎng)24h構(gòu)建OGD/R細(xì)胞模型用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。(3)實(shí)驗(yàn)分組：分別提取OGD/R刺激前后及antagomiR-200b預(yù)處理后的海馬細(xì)胞來源性外泌體：NC-Exo，OGD/R-Exo及antagomiR-200b+OGD/R-Exo。①antagomiR-200b轉(zhuǎn)染步驟如下：按照使用說明制備RNA-Lipofectamine 2000復(fù)合物，加到10μl的Opti-MEM中，室溫孵育20min，棄上清。PBS清洗細(xì)胞。每孔加入20μl RNA-Lipofectamine 2000復(fù)合物到96孔培養(yǎng)板中， 37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6h后，吸掉上清液，加入100μl的完全培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h。先轉(zhuǎn)染再進(jìn)行OGD/R處理;②收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液，2000×g離心30min后濾膜過濾，去除凋亡細(xì)胞、碎片及大的粒子(外泌體的提取步驟參考說明書)。取上清，加1/2體積的Total Exosome Isolation，4℃過夜。將過夜放置后的樣品10000×g，4℃離心1h。棄上清，根據(jù)沉淀的量加入適量的PBS重懸沉淀，即得外泌體。將提取的外泌體在電鏡下進(jìn)行形態(tài)觀察并拍照，NTA技術(shù)檢測外泌體直徑，應(yīng)用Western blot法檢測外泌體表面標(biāo)記分子CD63的表達(dá);③取各組外泌體(100μg/ml)與正常海馬細(xì)胞在常溫、常氧條件下共培養(yǎng)24h,實(shí)驗(yàn)分組如下:A組:與NC-Exo共培養(yǎng)；B組:與OGD/R-Exo共培養(yǎng)；C組:與antagomiR-200b+OGD/R-Exo共培養(yǎng)。(4)實(shí)時(shí)PCR檢測miR-200表達(dá)：按照Trizol試劑說明書提取外泌體及受體細(xì)胞中RNA。采用第一鏈cDNA合成試劑盒合成cDNA，使用TaqMan MicroRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒配制反轉(zhuǎn)錄體系，在PCR反應(yīng)管中分別加入ddH2O、SybrGreen qPCR Master Mix、Forward primer、Reverse primer、cDNA模板，充分混勻。擴(kuò)增條件：94℃ 10min，(94℃ 20s, 55℃ 20s, 72℃ 20s) 40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，2-ΔΔCT值評(píng)估m(xù)iRNA的相對(duì)表達(dá)量，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。(5) MTT檢測受體細(xì)胞增殖：將海馬細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/毫升，接種于96孔培養(yǎng)板，與各組外泌體共培養(yǎng)24h后，以MTT比色法檢測受體細(xì)胞增殖：每孔加入15μl的MTT，37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)避光孵育4h。吸凈孔內(nèi)的液體，加入200μl DMSO，室溫于搖床震蕩10min。酶標(biāo)儀630nm波長測出同一時(shí)間點(diǎn)A值，用測得的A值進(jìn)行細(xì)胞活性的分析。(6)DHE探針檢測受體細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)：用無血清培養(yǎng)基稀釋DHE探針(1∶2000)，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育細(xì)胞20min。每隔3～5min顛倒混勻下，使探針和細(xì)胞充分接觸。用無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次，充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DHE。將細(xì)胞置于熒光顯微鏡下觀察拍照，根據(jù)熒光信號(hào)強(qiáng)度分析ROS水平。(7)Western blot法檢測凋亡相關(guān)蛋白：同上方法收集細(xì)胞。每組分別加入300μl的RIPA裂解液，并加入適量的PMSF，置于冰上裂解1h；12000r/min，4℃離心10min；移上清于新的EP管中，進(jìn)行BCA蛋白質(zhì)定量。10%SDS-PAGE電泳分離蛋白樣品。PVDF轉(zhuǎn)膜90min，恒流200mA。5%脫脂奶粉封閉液封存非特異性抗原結(jié)合位點(diǎn)，按抗體說明書加入Bcl-xl、Bcl-2、Bax和GAPDH一抗及相應(yīng)二抗，ECL顯色，暗室X膠片顯影，拍照后進(jìn)行條帶灰度分析。

結(jié) 果

1.原代海馬細(xì)胞的分離鑒定與OGD/R刺激：原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞種板12h，大部分細(xì)胞可貼壁，少數(shù)細(xì)胞伸出1～2個(gè)突起。培養(yǎng)3天后，神經(jīng)元突起進(jìn)一步增多并延長，形成網(wǎng)格，胞體呈橢圓形，椎體形；海馬神經(jīng)元細(xì)胞OGD/R處理后存活率下降，出現(xiàn)胞體腫脹，胞膜不完整，核固縮，突起減少等形態(tài)變化(圖1A)。免疫熒光結(jié)果顯示細(xì)胞NSE的表達(dá)呈陽性，細(xì)胞純度>90%，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)(圖1B)。

圖1 原代海馬細(xì)胞分離鑒定與OGD/R造模(×400)A.OGD/R刺激前后海馬細(xì)胞形態(tài)(標(biāo)尺50μm);B.海馬細(xì)胞免疫熒光鑒定圖

2.外泌體分離鑒定: Western blot法檢測結(jié)果顯示外泌體表面可表達(dá)CD63表面分子標(biāo)志物(圖2A)；NTA技術(shù)檢測外泌體的粒徑分布，直徑主要集中在70～80nm，平均直徑為104.0±57.5nm(圖2B)。在投射電鏡下觀察外泌體呈圓形或橢圓形囊泡狀，可分散或聚集分布(圖2C)。

圖2 外泌體提取與鑒定 A.外泌體表面特異性膜蛋白CD63表達(dá)；B.外泌體粒徑分布；C.透射電鏡下外泌體形態(tài)

3.OGD/R外泌體中miR-200家族表達(dá)上調(diào)，其中miR-200b最顯著：與NC-Exo比較，OGD/R-Exo中miR-200家族成員均表達(dá)上調(diào)，其中miR-200b上調(diào)最為顯著(P<0.01)，故選擇miR-200b進(jìn)行深入研究；為進(jìn)一步確定共培養(yǎng)后海馬細(xì)胞內(nèi)的變化，將所提取的NC-Exo、OGD/R-Exo和antagomiR-200b+OGD/R-Exo與正常海馬細(xì)胞共培養(yǎng)24h，提取受體細(xì)胞內(nèi)的miRNA,發(fā)現(xiàn)與A組(與NC-Exo共培養(yǎng))比較，OGD/R-Exo使受體細(xì)胞內(nèi)miR-200b表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01);與B組(與OGD/R-Exo)比較，OGD/R刺激之前預(yù)先用antagomiR-200b處理海馬細(xì)胞，此來源的外泌體使受體細(xì)胞內(nèi)miR-200b表達(dá)下調(diào)(P<0.01，圖3)。

圖3 RT-PCR檢測外泌體及共培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)miR-200家族表達(dá)與A組比較，*P<0.01；與B組比較,#P<0.01

4.miR-200b高表達(dá)的外泌體導(dǎo)致受體細(xì)胞增殖抑制：MTT檢測結(jié)果表明，與A組(與NC-Exo共培養(yǎng))比較，OGD/R-Exo可抑制受體細(xì)胞增殖(P<0.01)；與B組(與OGD/R-Exo共培養(yǎng))比較，OGD/R刺激之前預(yù)先用antagomiR-200b轉(zhuǎn)染海馬細(xì)胞，此來源的外泌體可改善共培養(yǎng)細(xì)胞的狀態(tài)，修復(fù)受損細(xì)胞(P<0.01,圖4)。

圖4 MTT檢測外泌體共培養(yǎng)后細(xì)胞增殖情況與A組比較,*P<0.01；與B組比較,#P<0.01

5.miR-200b高表達(dá)的外泌體誘導(dǎo)受體細(xì)胞ROS水平升高：將miR-200b高表達(dá)的OGD/R-Exo與正常海馬細(xì)胞共培養(yǎng)24h后，采用DHE探針檢測受體細(xì)胞內(nèi)ROS水平，結(jié)果可知與A組比較，OGD/R-Exo共培養(yǎng)后受體細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，提示ROS的釋放量增加；與B組比較，OGD/R刺激之前預(yù)先向海馬細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染antagomiR-200b，它所分泌的外泌體使共培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度減弱，提示此外泌體可逆轉(zhuǎn)受體細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高(圖5)。

6.miR-200b高表達(dá)的外泌體誘導(dǎo)受體細(xì)胞凋亡：與A組(與NC-Exo共培養(yǎng))比較，B組抗凋亡蛋白Bcl-xl和Bcl-2表達(dá)減少，凋亡蛋白Bax蛋白表達(dá)增多(P<0.01)；與B組(與OGD/R-Exo共培養(yǎng))比較，antagomiR-200b預(yù)處理后的外泌體可使抗凋亡蛋白Bcl-xl和Bcl-2表達(dá)增多，凋亡蛋白Bax表達(dá)減少(P<0.01，圖6)。

圖5 共培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)ROS水平熒光圖像A.與NC-Exo共培養(yǎng)(A組);B.與OGD/R-Exo共培養(yǎng)(B組);C.與antagomiR-200b+OGD/R-Exo共培養(yǎng)(C組)

圖6 共培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白免疫印跡分析及蛋白定量與A組比較,*P<0.01；與B組比較,#P<0.01

討 論

外泌體可由大部分細(xì)胞釋放并存在于幾乎所有體液中，作為細(xì)胞釋放出來的囊泡，可以在相鄰或遠(yuǎn)端細(xì)胞間遞送miRNA、mRNA、非編碼RNA、細(xì)胞蛋白等多種生物活性分子，介導(dǎo)細(xì)胞間物質(zhì)交換并引起信號(hào)反應(yīng)。細(xì)胞所釋放的miRNA主要包裹于外泌體中，作為分泌分子影響受體細(xì)胞表型[11, 12]。研究發(fā)現(xiàn)外泌體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞交流網(wǎng)絡(luò)發(fā)揮了重要的作用。神經(jīng)元可分泌外泌體到腦實(shí)質(zhì)中被鄰近細(xì)胞內(nèi)吞或釋放到腦脊液中傳輸?shù)狡渌课籟13]；外泌體還可以到達(dá)突觸間隙，被突觸后或突觸前神經(jīng)元攝取，對(duì)突觸的可塑性和神經(jīng)元再生發(fā)揮調(diào)控作用[14]。由于多數(shù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病損傷形成機(jī)制尚不明確，治療手段相對(duì)匱乏，外泌體及其內(nèi)含的miRNA研究成為了科研及臨床研究的熱點(diǎn)之一。

本研究分離培養(yǎng)原代海馬細(xì)胞，并成功從其培養(yǎng)基中獲得了外泌體， Western blot法鑒定特異性表面標(biāo)志蛋白CD63陽性；外泌體直徑集中在70～80nm，平均直徑為(104.0±57.5)nm與目前大多數(shù)文獻(xiàn)結(jié)果一致；投射電鏡下觀察其近似為圓形的囊泡。綜合以上結(jié)果，證實(shí)所提取物為外泌體。

miRNA的調(diào)控作用幾乎囊括了所有真核生物的基本生物學(xué)過程，其中miR-200家族可參與調(diào)控中樞神經(jīng)系統(tǒng)的分化與增殖、神經(jīng)存活和突觸功能[15, 16]。miR-200家族在腦缺血、缺氧損傷方面也存在明顯的表達(dá)差異。Stary等[17]發(fā)現(xiàn)在腦缺血損傷小鼠模型中抑制miR-200c的表達(dá)可降低腦損傷程度。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，在缺氧/復(fù)氧HT-22細(xì)胞模型中可觀察到miR-200家族表達(dá)上調(diào)，抑制miR-200家族表達(dá)可以通過減少ROS的產(chǎn)生降低缺氧/復(fù)氧導(dǎo)致的神經(jīng)元細(xì)胞死亡[18]。阿爾茲海默病患者及動(dòng)物模型相關(guān)腦區(qū)miR-34a高度表達(dá)，miR-34a高表達(dá)外泌體被鄰近神經(jīng)元細(xì)胞攝取后，受體細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)β-樣淀粉蛋白形成與沉積[19]。星形膠質(zhì)細(xì)胞感染HIV Tat后，它所分泌的外泌體內(nèi)miR-29b含量增加，神經(jīng)元細(xì)胞攝取該外泌體后，細(xì)胞內(nèi)miR-29表達(dá)上調(diào)并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和壞死，干預(yù)外泌體的形成可逆轉(zhuǎn)這一過程[20]。本研究中，筆者成功構(gòu)建海馬細(xì)胞OGD/R模型，發(fā)現(xiàn)OGD/R刺激后海馬細(xì)胞內(nèi)miR-200b表達(dá)顯著上調(diào),將miR-200b高度表達(dá)的OGD/R-Exo與正常海馬細(xì)胞共培養(yǎng)，受體細(xì)胞內(nèi)miR-200b表達(dá)顯著增加，以antagomiR-200b預(yù)處理后，受體細(xì)胞內(nèi)miR-200b表達(dá)下調(diào)。這些結(jié)果提示神經(jīng)元之間可通過外泌體轉(zhuǎn)運(yùn)損傷相關(guān)的miR-200b，這與多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道的外泌體RNA傳遞作用一致。

缺血/再灌注損傷是CPB的主要病理生理之一，組織器官在缺血/再灌注之后產(chǎn)生大量的自由基，過量自由基可以與核酸、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)反應(yīng)并最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和壞死。OGD/R-Exo與正常海馬細(xì)胞共培養(yǎng)后，受體細(xì)胞出現(xiàn)增殖受抑和胞內(nèi)ROS增多；antagomiR-200b+OGD/R-Exo可使共培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)ROS水平恢復(fù)。Bcl-2、Bcl-xl和Bax分別是主要的抑制凋亡和促進(jìn)凋亡蛋白，通過檢測Bcl-2、Bcl-xl與Bax的表達(dá)量可以反映出細(xì)胞凋亡情況[21]。共培養(yǎng)之后，受體細(xì)胞內(nèi)Bcl-2、Bcl-xl水平降低，Bax水平升高；而以antagomiR-200b抑制miR-200b高表達(dá)外泌體的形成則可逆轉(zhuǎn)這一過程，提示神經(jīng)元之間可能通過外泌體miR-200b進(jìn)行損傷“毒性”的散布，進(jìn)而促進(jìn)OGD/R相關(guān)損傷形成與發(fā)展。

綜上所述，外泌體可以通過轉(zhuǎn)運(yùn)miR-200b傳播OGD/R神經(jīng)元細(xì)胞損傷信息，介導(dǎo)細(xì)胞損傷，促進(jìn)OGD/R相關(guān)腦損傷形成。但是，本研究僅分析了外泌體miR-200b在OGD/R細(xì)胞模型中的作用，今后將納入其他miR-200家族成員，深入探討外泌體miRNA在體外循環(huán)腦損傷中可能的機(jī)制。