成曉東, 李云萍, 賀銀菊(黔南民族師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院,貴州 都勻 558000)

Alpert[1]于1990年首次提出親水作用色譜(HILIC)的概念。HILIC的固定相表面通常鍵合極性基團(tuán),流動(dòng)相則一般由60%～95%的乙腈和水或者緩沖溶液混合組成[2],解決了極性化合物在正相色譜(NPLC)中溶解度差、在反相色譜(RPLC)中保留弱的難題,且流動(dòng)相中高含量的有機(jī)溶劑使得其非常適合與質(zhì)譜聯(lián)用[3]。由于HILIC在分離極性化合物上獨(dú)到的優(yōu)勢(shì),近年來其在藥物化學(xué)、糖原組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)、環(huán)境科學(xué)、農(nóng)業(yè)和食品化學(xué)等領(lǐng)域的應(yīng)用愈加廣泛[4]。

親水固定相的研究是親水色譜研究的核心內(nèi)容。而高性能色譜固定相的研制更是促進(jìn)親水色譜發(fā)展的關(guān)鍵。親水色譜固定相的鍵合相種類非常豐富,商家提供的商品化親水色譜柱以及各種學(xué)術(shù)報(bào)道和文獻(xiàn)中出現(xiàn)的親水作用色譜材料種類層出不窮[4-6]。目前在親水作用色譜柱中應(yīng)用比較廣泛的有未衍生化硅膠、醇基、氰基、氨基、糖類、酰胺、聚(琥珀酰亞胺)等鍵合固定相[7-9]。這些固定相的制備和研究極大促進(jìn)了HILIC的發(fā)展和應(yīng)用。

兩性色譜固定相是親水色譜固定相中比較特殊的一種,由于其表面同時(shí)含有帶正負(fù)電荷的基團(tuán),極大地增強(qiáng)了固定相的極性,在分離極性化合物上有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[10]。通常制備兩性固定相是在色譜硅膠表面通過化學(xué)反應(yīng)同時(shí)引入含正負(fù)電荷的基團(tuán),而正負(fù)電荷在硅膠表面的空間排布以及帶電基團(tuán)的種類對(duì)固定相的色譜行為將產(chǎn)生決定性的影響[11-13]。

如圖1所示,a、b為早期出現(xiàn)的兩性固定相構(gòu)型[14-18]。a構(gòu)型最經(jīng)典的代表是磷酸膽堿型兩性固定相,其正負(fù)電荷分布與硅膠表面垂直,近端為帶負(fù)電的膦酸基團(tuán),遠(yuǎn)端為季銨鹽基團(tuán)。硫代甜菜堿型兩性固定相則是b構(gòu)型的典型,其近端為帶正電的季銨鹽基團(tuán),末端為帶負(fù)電荷的磺酸根。近年來,類似構(gòu)型的兩性固定相也相繼出現(xiàn),如Qiao等[4]合成的咪唑磺酸根兩性固定相、Armstrong等[11]制備了3-P,P-二苯基磷-丙基磺酸根型兩性固定相。這些兩性固定相在極性化合物的分離上取得了很好的效果,其中咪唑磺酸根兩性固定相在分離胞嘧啶時(shí)理論塔板數(shù)可以達(dá)到100 000 plates/m。這些兩性固定相表面的帶電基團(tuán)都有較強(qiáng)的離子交換能力,一般情況下很難通過調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值去改變固定相本身的帶電情況。

圖1 兩性固定相構(gòu)型示意圖Fig.1 Immobilized patterns of zwitterionic stationary phases X+:positively charged groups;Y-:negatively charged groups.

Shen等[19]制備了如圖1c所示的一種新構(gòu)型的兩性固定相,他們通過點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)將半胱氨酸引入到硅膠表面,其正負(fù)電荷排布與硅膠表面平行,可以與分析物充分地接觸。這種固定相的表面是具有弱離子交換能力的羧基和氨基,可以通過改變流動(dòng)相的酸堿度來調(diào)節(jié)固定相的帶電狀態(tài),這使固定相在分離帶電化合物時(shí)可以更加靈活地調(diào)整流動(dòng)相條件來達(dá)到想要的分離選擇性,進(jìn)一步擴(kuò)大了這種固定相的應(yīng)用范圍。他們將這種固定相應(yīng)用在堿性化合物、多肽和多聚糖的分離上,效果顯著。

在本課題組的早期工作中,通過對(duì)氨基鍵合硅膠進(jìn)一步改性,在其表面引入磷酸基團(tuán),制備了一種如圖1d構(gòu)型的兩性固定相,并將其成功應(yīng)用在有機(jī)酸、核苷以及水溶性維生素的分離中[20]。由于這份工作中無(wú)法定量地調(diào)節(jié)氨基與磷酸基團(tuán)的比例,嘗試將不同比例的氨基和巰基的硅烷偶聯(lián)劑鍵合到硅膠表面,再利用巰基與乙烯基膦酸之間的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)將膦酸基團(tuán)引入到硅膠表面,制備了一種可調(diào)節(jié)正負(fù)離子比例的兩性親水色譜固定相。通過元素分析表征了固定相的成功合成,并通過N、P元素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)確定氨基與膦酸基團(tuán)的比例。選取一系列經(jīng)典的極性小分子,考查了分析物在固定相上的保留機(jī)理。最后通過比較核苷、水溶性維生素、堿性化合物、苯甲酸這幾類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在3種色譜柱上的保留行為來對(duì)比3種不同電荷比例的固定相的分離選擇性與色譜性能。結(jié)果表明,對(duì)于不同的分析物,3種固定相表現(xiàn)出完全不同的分離選擇性和色譜行為。表明此類固定相在極性化合物的分離上具有良好的應(yīng)用前景。

圖2 兩性硅膠固定相氨基膦酸鍵合硅膠(APS)的合成過程Fig.2 Synthesis procedure for the zwitterionic silica stationary phases (amino-phosphate-based stationary phases,APS)MAS:mercapto-amino based stationary phases;MeOH:methanol;AIBN:2,2′-azobis (2-methylpropionitrile).

表1 3種MAS固定相的制備反應(yīng)投料比Table 1 Reaction ratios for the preparation of three mercapto-amino based stationary phases (MAS)

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Vario EL III Universal CHNOS型元素分析儀(德國(guó)Elementar公司);比表面及孔徑分析儀(北京精微高博科學(xué)技術(shù)有限公司);1200型高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)。

球形硅膠(直徑5 μm,孔徑10 nm,比表面積300 m2/g,日本DAISOGEL公司);維生素(B1、B2、B3、B3-amide、B6、B12)、乙烯基膦酸、克倫特羅、核苷與堿基、2,2′-偶氮二異丁腈(AIBN)、茶堿、黃連素、普魯卡因、藥根堿購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;γ-巰丙基三乙氧基硅烷(MPTS)、N-β-氨乙基-γ-氨丙基三甲氧基硅烷(NAPTS)購(gòu)自武大有機(jī)硅新材料公司;乙腈、甲醇、丙酮、甲苯、乙酸、乙酸銨、苯甲酸類物質(zhì)購(gòu)自上海國(guó)藥試劑。以上試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)所用蒸餾水均采用Milli-Q純水系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司)純化。

1.2 實(shí)驗(yàn)條件

1.2.1固定相的制備

如圖2所示,首先按3種不同反應(yīng)物比例制備了同時(shí)鍵合有巰基與氨基的固定相(mercapto-amino based stationary phases,MAS)。將5 g活化硅膠分散于30 mL甲苯中,按表1中的投料比加入所需反應(yīng)物,在N2保護(hù)下于110 ℃回流反應(yīng)24 h后過濾,洗滌后真空干燥過夜。取5 g制得的MAS-1、MAS-2和MAS-3分別分散于100 mL無(wú)水甲醇中,加入1 g乙烯基膦酸(過量)與30 mg AIBN,于60 ℃下機(jī)械攪拌回流反應(yīng)24 h。分別用甲苯、乙醇、水和丙酮洗滌3次后,于60 ℃真空環(huán)境下干燥過夜,即得氨基膦酸鍵合硅膠(amino-phosphate-based stationary phases,分別命名為APS-1、APS-2和APS-3)。

1.2.2色譜柱的填裝

以甲醇作為淋洗劑,異丙醇為勻漿劑,用裝柱機(jī)在50 MPa的壓力下填裝30 min,將所得的不同離子比例的兩性固定相填裝入150 mm×4.6 mm的不銹鋼色譜柱中。

1.2.3色譜條件

色譜分離均在安捷倫1200 HPLC系統(tǒng)上進(jìn)行。流動(dòng)相為不同比例的有機(jī)溶劑與緩沖鹽溶液的混合物,過濾與超聲脫氣處理后使用。流動(dòng)相流速為1 mL/min;柱溫為30 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)為254或230 nm。所有的色譜測(cè)量均重復(fù)3次以上。

2 結(jié)果與討論

2.1 材料表征

首先對(duì)反應(yīng)前活化硅膠以及合成的不同基團(tuán)比例的MAS與APS材料進(jìn)行了孔徑及比表面分析的對(duì)比。如表2所示,同反應(yīng)前的活化硅膠相比,MAS與APS材料的比表面、平均孔徑都明顯減小,表明相關(guān)的基團(tuán)已成功鍵合到硅膠表面。為了進(jìn)一步表征固定相的成功合成,對(duì)活化硅膠、MAS以及APS進(jìn)行了元素分析,其中C、N元素的含量通過元素分析儀檢測(cè),P元素含量通過鉬藍(lán)法測(cè)得。如表2所示,MAS中C與N的含量在反應(yīng)后明顯增加,表明氨基已成功引入到硅膠表面。APS中P元素的含量較MAS中的含量明顯增加則表明膦酸基團(tuán)已通過乙烯基與巰基之間的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)成功鍵合到硅膠表面。由于乙烯基膦酸和巰基之間的反應(yīng)效率不可能達(dá)到100%,所以不能完全準(zhǔn)確地通過改變反應(yīng)物比例來控制最終APS固定相材料中正負(fù)電荷的比例,但仍可以通過測(cè)定APS中N與P的質(zhì)量分?jǐn)?shù)來確定氨基與膦酸基團(tuán)的摩爾比。表2根據(jù)測(cè)得的N與P的質(zhì)量分?jǐn)?shù)列出了APS固定相填料中實(shí)際的氨基與膦酸基團(tuán)的比例。綜上,氨基與膦酸基團(tuán)已成功引入到硅膠固定相的表面。

表2 孔結(jié)構(gòu)與元素分析結(jié)果Table 2 Pore structure and elemental analysis results

ND:not detected.

圖3 乙腈含量對(duì)分析物在APS固定相上保留因子(k)的影響Fig.3 Effects of acetonitrile content on the retention factor (k)of tested analytes on the APS stationary phases

2.2 固定相的色譜行為研究

2.2.1流動(dòng)相中乙腈含量對(duì)分析物保留的影響

分析物在固定相上的保留與流動(dòng)相組成息息相關(guān)[21]。保持流動(dòng)相中緩沖鹽的濃度和pH值不變,考察了流動(dòng)相中乙腈含量對(duì)常見極性化合物在固定相上保留的影響。以APS-1色譜柱為例,如圖3所示,選取煙酰胺、胞嘧啶、腺苷、尿苷、胞苷、脫氧胞苷為分析物,保持流動(dòng)相中乙酸銨緩沖鹽濃度為50 mmol/L,pH值為6.5,調(diào)節(jié)流動(dòng)相中乙腈含量從70%至90%。這些極性分析物在色譜柱上的保留隨著流動(dòng)相中乙腈含量不斷增大而逐漸增強(qiáng),表現(xiàn)出典型的親水保留特征。

長(zhǎng)期以來親水色譜的溶質(zhì)保留機(jī)理存在著一定程度的爭(zhēng)議。主流的觀點(diǎn)認(rèn)為在分離過程中,極性固定相的表面會(huì)吸附流動(dòng)相中的水分子,使得固定相的表面形成水層,約4%～13%的硅膠孔體積會(huì)被水分子占據(jù)。溶質(zhì)分子會(huì)在水層與流動(dòng)相之間達(dá)到分配平衡[1,22,23]。該觀點(diǎn)認(rèn)為溶質(zhì)的保留因子與流動(dòng)相水含量之間存在這樣的關(guān)系式:

lgk=lgkw-Sφ

(1)

其中k為溶質(zhì)分子的保留因子,kw為僅用乙腈為流動(dòng)相時(shí)溶質(zhì)的保留因子,φ為流動(dòng)相中水的含量,S為lgk對(duì)φ線性擬合時(shí)的斜率。

另一種觀點(diǎn)則為正相色譜中常見的吸附機(jī)理[24,25]。這種理論認(rèn)為極性分析物與極性固定相之間存在著一種吸附與解析的過程。這種觀點(diǎn)早期不被大家所接受的原因是:通常正相色譜中流動(dòng)相是不含水的,因?yàn)樗臉O性比較大,會(huì)迅速占據(jù)吸附位點(diǎn)導(dǎo)致分析物的保留減弱。而親水色譜的流動(dòng)相中含有較多的水分子,如果分析物是通過吸附作用于固定相上的話會(huì)被水分子迅速替換掉。然而隨著對(duì)HILIC保留機(jī)理的研究越來越深入,越來越多的文獻(xiàn)[19-21]報(bào)道氫鍵作用、偶極矩作用以及靜電作用均能與溶質(zhì)分子產(chǎn)生吸附作用。因此仍有不少人認(rèn)同HILIC中的吸附機(jī)理。該觀點(diǎn)中保留因子與流動(dòng)相中水含量的關(guān)系式:

lgk=lgkw-nlgφ

(2)

其中n是固定相表面單位面積上溶質(zhì)分子與水分子的物質(zhì)的量之比。

近年來有相關(guān)色譜工作[26]對(duì)于HILIC的保留機(jī)理提出了一種新的理論,該理論認(rèn)為在親水色譜中,分析物在固定相表面所吸附的水層與流動(dòng)相之間存在著分配作用,而由于固定相結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性,極性分析物與固定相表面之間的靜電作用以及氫鍵作用也不可避免,導(dǎo)致了分析物在固定相上是多重保留機(jī)理,分析物的保留因子與流動(dòng)相中水的含量存在如下的關(guān)系:

lgk=a+m1φ-m2lgφ

(3)

其中a在一定條件下為常數(shù),m1同式(1)中的-S,m2同式(2)中的n。

依照這3種模型采用多重回歸分析考察了分析物在3種不同離子比例的固定相上的保留和水含量之間的關(guān)系,進(jìn)一步探討固定相的保留機(jī)理。表3列出了分析物在APS-1、APS-2、APS-3色譜柱上的保留隨流動(dòng)相中水含量的關(guān)系,采用3種理論模型進(jìn)行多重回歸分析得到相關(guān)系數(shù)。從表中可以看出,對(duì)于3種色譜柱而言,模型(3)的相關(guān)系數(shù)最接近1。表明極性化合物在3種色譜柱上的保留是多重保留機(jī)理而不是單純的分配或者吸附機(jī)理。

表3 分析物在3種APS色譜柱上的保留與流動(dòng)相中水含量根據(jù)方程(1)、(2)和(3)擬合的相關(guān)系數(shù)(r)Table 3 Correlation coefficients (r)of fitting the equations (1),(2)and (3)for the retention of the tested analytes vs.water content of the mobile phase on the three APS-columns

Eq.:equation.

2.2.2流動(dòng)相pH值對(duì)分析物保留的影響

圖4 流動(dòng)相緩沖液pH值對(duì)分析物在3種APS固定相上k的影響Fig.4 Effect of buffer pH in the mobile phase on k of tested solutes on the three APS columns Mobile phase:acetonitrile (ACN)-100 mmol/L ammonium acetate (80∶20,v/v).VB:vitamin B.

流動(dòng)相酸堿度可以改變?nèi)苜|(zhì)分子與固定相的帶電情況,從而對(duì)分析物的保留行為產(chǎn)生非常重要的影響[27]。固定流動(dòng)相中乙腈含量為80%,乙酸銨緩沖鹽濃度為100 mmol/L。選取苯甲酸、水楊酸、維生素B3、維生素B1、克倫特羅、煙酰胺為探針分子,對(duì)比了這些分析物在3種固定相APS-1、APS-2、APS-3上的保留隨著pH從3.5～6.5的變化趨勢(shì)。如圖4所示,在APS-1上,苯甲酸(pKa=4.2)所帶負(fù)電荷隨著pH從6.5～3.5逐漸減少,與帶正電荷的固定相之間的靜電吸引逐漸減弱,故其保留時(shí)間逐漸減小。另一種酸性物質(zhì)水楊酸的保留時(shí)間變化趨勢(shì)則與之完全相反,這是由于隨著流動(dòng)相的pH值逐漸降低,水楊酸的分子內(nèi)氫鍵被逐漸破壞,與固定相之間的氫鍵作用逐漸增強(qiáng),故保留增強(qiáng)。VB3有著特殊的結(jié)構(gòu),表面含兩個(gè)可電離基團(tuán)叔氨基(pKa=3.0)與羧基(pKa=3.8)。當(dāng)pH從6.5變至3.5時(shí),VB3從帶負(fù)電荷慢慢轉(zhuǎn)變成帶正電荷,與其在固定相上的保留先增強(qiáng)再減弱的行為是一致的。這3種物質(zhì)在APS-2和APS-3上的保留變化趨勢(shì)非常相似,都隨著pH值降低保留逐漸增強(qiáng)。這是由于在此條件下,帶負(fù)電荷的固定相與分析物均隨著pH值降低所帶負(fù)電荷逐漸減少,靜電排斥力減弱。其中例外的是苯甲酸在APS-2與APS-3上的保留在pH為3.5時(shí)急劇減弱,這是由于苯甲酸pKa為4.2,在pH為3.5時(shí)多數(shù)以電中性分子狀態(tài)存在,極性大大減小,與固定相之間的親水作用減弱。APS-2與APS-3上堿性物質(zhì)VB1與克倫特羅隨著pH值降低、保留減弱則是由于固定相所帶負(fù)電荷逐漸減少使其與分析物之間的靜電吸引力減弱。VB1與克倫特羅在APS-1上保留較弱,保留時(shí)間幾乎不變。中性物質(zhì)煙酰胺的保留則在APS-1、APS-2、APS-3這3種固定相上幾乎不隨pH改變而變化。

圖5 流動(dòng)相中鹽濃度對(duì)分析物在3種APS固定相上k的影響Fig.5 Effect of buffer concentration in the mobile phase on k of the tested solutes on the three APS columns Mobile phase:ACN-ammonium acetate (80∶20,v/v,pH 6.5).c:buffer concentration,mmol/L.

2.2.3流動(dòng)相鹽濃度對(duì)分析物保留的影響

流動(dòng)相中緩沖鹽的存在能極大地影響分析物的保留[28]。固定流動(dòng)相中乙腈的含量為80%、緩沖鹽pH值為6.5,調(diào)節(jié)緩沖鹽濃度為5、25、50、75、100 mmol/L。對(duì)比了苯甲酸、水楊酸、VB3、VB1以及克倫特羅等5種極性分析物在APS-1、APS-2、APS-3固定相上的保留隨鹽濃度變化的趨勢(shì),如圖5所示。對(duì)于APS-1而言,鹽濃度的增加削弱了帶正電荷的堿性物質(zhì)VB1、克倫特羅與帶正電的固定相之間的靜電排斥力,導(dǎo)致其保留隨鹽濃度增大而逐漸增強(qiáng)。反之,酸性物質(zhì)(苯甲酸、水楊酸以及VB3)的保留因子均隨鹽濃度增加而減小,則是由于鹽濃度的增加削弱了分析物與固定相之間的靜電吸引作用。而在APS-2與APS-3上,膦酸基團(tuán)占主導(dǎo)地位,故其在實(shí)驗(yàn)條件中帶負(fù)電荷,與APS-1恰好相反,所以分析物在APS-2與APS-3上的保留隨鹽濃度的變化趨勢(shì)與APS-1截然相反。分析物在APS-2與APS-3上的保留行為變化趨勢(shì)類似,但是由于所鍵合基團(tuán)的比例不同,故其在兩種色譜柱上的保留因子隨鹽濃度變化的幅度也存在一定差異。

2.3 固定相分離選擇性對(duì)比

為進(jìn)一步對(duì)比APS-1、APS-2、APS-3這3種固定相的色譜性能,探討兩性固定相中不同的基團(tuán)比例對(duì)固定相分離選擇性的影響,選取了核苷、水溶性維生素、有機(jī)酸、堿性物質(zhì)這幾類常見極性化合物為分析物,在相同的色譜條件下對(duì)比了這些分析物在3種色譜柱上的分離情況。

核苷是核酸的主要組分,在細(xì)胞內(nèi)具有非常顯著的生理功能,近年來更是作為腫瘤過程的潛在生物標(biāo)志物,在生物化學(xué)分析中愈發(fā)引起重視[5]。它們同時(shí)也是親水固定相色譜評(píng)價(jià)的常見標(biāo)準(zhǔn)品。如圖6a為3種APS固定相對(duì)9種核苷和堿基的分離圖。從圖中可以看出,APS-1能提供最佳的分離效果和峰形,美中不足的是胸苷和2′-脫氧腺苷在同一時(shí)間出峰。APS-2則在此色譜條件下能較好地分離這些核苷類物質(zhì)。而APS-3的分離效果不甚理想。

圖6 (a)核苷類物質(zhì)、(b)水溶性維生素、(c)有機(jī)酸及(d)堿性物質(zhì)在APS-1、APS-2、APS-3色譜柱上的分離Fig.6 Separation of (a)nucleosides,(b)water-soluble vitamins,(c)organic acids and (d)basic compounds on APS columns a.Mobile phase:ACN-water (85∶15,v/v).Peak Nos.:1.thymidine;2.2′-deoxyadenosine;3.adenosine;4.2′-deoxycytidine;5.uridine;6.cytidine;7.2′-deoxyguanosine;8.guanosine;9.inosine.b.Mobile phase:ACN-50 mmol/L ammonium acetate (80∶20,v/v,pH 6.5).Peak Nos.:1.nicotinamide;2.VB6;3.VB2;4.VB1;5.VB3;6.VB12.c.Mobile phase:ACN-50 mmol/L ammonium acetate (85∶15,v/v,pH 4.0).Peak Nos.:1.anthranilic acid;2.4-nitrobenzoic acid;3.benzoic acid;4.4-hydroxybenzoic acid;5.2-bromobenzoic acid.d.Mobile phase:ACN-50 mmol/L ammonium acetate (85∶15,v/v,pH 4.0).Peak Nos.:1.theophylline;2.berberine;3.jateorhizine;4.procaine;5.clenbuterol.

維生素是一類非常重要的微量有機(jī)物質(zhì),在人體生長(zhǎng)、代謝、發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用。水溶性維生素極性適中,常作為親水評(píng)價(jià)的探針分子[29]。試驗(yàn)選取了煙酰胺、VB1、VB2、VB3、VB6、VB12 6種水溶性維生素為分析物,對(duì)比了它們?cè)?種APS色譜柱上的分離效果。如圖6b所示,3種固定相都對(duì)水溶性維生素有較好的分離效果。而由于固定相的極性以及帶電情況不同,6種水溶性維生素的保留時(shí)間存在著一定的差異。VB6在研究條件下帶正電荷,故其在帶負(fù)電荷的APS-2與APS-3色譜柱上保留時(shí)間更長(zhǎng)。而VB3在流動(dòng)相中帶負(fù)電荷,與帶正電荷的APS-1固定相產(chǎn)生靜電吸引導(dǎo)致保留增強(qiáng),與帶負(fù)電荷的APS-2與APS-3產(chǎn)生靜電排斥導(dǎo)致保留減弱。

苯甲酸及其衍生物是一類非常重要的工業(yè)原料及醫(yī)藥中間體,選取5種苯甲酸類物質(zhì)進(jìn)一步考察3種APS固定相的表面帶電情況及其對(duì)酸性物質(zhì)的分離選擇性。如圖6c所示,由于苯甲酸在此色譜條件下帶負(fù)電荷,與帶負(fù)電荷的APS-2與APS-3固定相產(chǎn)生靜電排斥,保留大大減弱,所以幾種苯甲酸類物質(zhì)集中在前幾分鐘出峰。而APS-1對(duì)于這類苯甲酸物質(zhì)有著極佳的分離選擇性和峰形。因此在分離酸性物質(zhì)時(shí),APS-1是更佳的選擇。

堿性藥品在日常生活中應(yīng)用非常廣泛,選取常見的5種堿性物質(zhì)作為分析物來對(duì)比3種APS固定相對(duì)堿性物質(zhì)的分離選擇性。如圖6d所示,堿性物質(zhì)由于帶正電荷,在帶正電的APS-1固定相上保留極弱。APS-2與APS-3提供了更佳的分離選擇性。反常的是帶負(fù)電荷更多的APS-3固定相對(duì)于堿性化合物的分離選擇性反而不如APS-2,推測(cè)是分析物的保留不僅與固定相的帶電情況有關(guān),在很大程度上也與固定相的極性有關(guān),APS-3固定相的極性沒有APS-2大,導(dǎo)致對(duì)于這幾種堿性物質(zhì)的保留較弱。

結(jié)果表明,這3種不同基團(tuán)比例的APS色譜柱在核苷、水溶性維生素、有機(jī)酸、堿性物質(zhì)等4類常見化合物的分離中表現(xiàn)出不同的分離選擇性。因此可以根據(jù)實(shí)際應(yīng)用中分析物的帶電特性來選擇合適離子比例的APS固定相,表明固定相具有良好的應(yīng)用潛力。

2.4 固定相穩(wěn)定性和重現(xiàn)性的考察

進(jìn)一步考察了固定相的穩(wěn)定性與重現(xiàn)性。首先分別用pH值為2和9的溶液持續(xù)浸泡所制備的固定相24 h后裝柱,并選取腺苷和胞苷為分析物,與不經(jīng)過處理的APS-1色譜柱對(duì)比了保留因子與柱效。

如表4所示,在經(jīng)過pH為2的酸性溶液與pH為9的堿性溶液浸泡后的固定相上,腺苷與胞苷的保留因子與柱效和未處理的APS-1色譜柱無(wú)明顯差異。表明固定相具有良好的穩(wěn)定性。

表4 APS色譜柱穩(wěn)定性考察Table 4 Investigation of the stability of APS columns

N:theoretical plate numbers.

接著對(duì)所合成的不同批次的固定相的色譜重現(xiàn)性進(jìn)行了考察。以核苷類物質(zhì)為分析物,對(duì)比了它們?cè)诓煌蔚腁PS固定相上的保留因子、柱效以及色譜峰的對(duì)稱性。如表5所示,不同批次間的APS固定相的色譜行為幾乎一致,證明了固定相具有良好的重現(xiàn)性。

表5 3種色譜柱不同批次間的色譜數(shù)據(jù)Table 5 Chromatographic data for different batches of the three types of columns

fAS:symmetry factor.

3 結(jié)論

本研究利用混合配體的方法在活化硅膠表面引入不同比例的氨基和巰基,并進(jìn)一步利用巰基與乙烯基膦酸之間的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng),成功制備了可調(diào)節(jié)正負(fù)離子比例的兩性親水色譜固定相。成功表征后通過研究流動(dòng)相中乙腈含量、緩沖鹽pH值及緩沖鹽濃度等因素對(duì)探針分子在固定相上保留的影響,表明親水模式下極性分析物在固定相上是多重保留機(jī)理。對(duì)比核苷、水溶性維生素、堿性化合物、苯甲酸這幾類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在3種色譜柱上的保留行為,結(jié)果表明,對(duì)于不同性質(zhì)的分析物,3種固定相表現(xiàn)出不同的分離選擇性和色譜行為。可以靈活調(diào)節(jié)正負(fù)基團(tuán)的比例來滿足不同的分離需求,證明了固定相擁有良好的應(yīng)用前景。而由于多步反應(yīng)中反應(yīng)效率的限制,無(wú)法完全準(zhǔn)確地控制引入硅膠表面正負(fù)基團(tuán)的比例,這也將是今后工作中力爭(zhēng)解決的問題。