趙雪含，吳庚香，楊菁

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，湖北省輔助生殖與胚胎發(fā)育醫(yī)學(xué)研究中心，武漢 430060)

控制性促排卵(COH)是體外受精-胚胎移植(IVF-ET)的關(guān)鍵步驟，自促性腺激素類似物引入臨床應(yīng)用以來，內(nèi)源性促性腺激素(Gn)釋放得到有效控制，促排卵治療效率明顯升高[1]，但仍有部分卵巢儲(chǔ)備功能下降(DOR)的患者面臨傳統(tǒng)促排卵方案卵巢反應(yīng)差，早發(fā)LH峰增多，獲得優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞與胚胎較少，難以獲得理想妊娠結(jié)局的困境[2]。

近年來胚胎冷凍技術(shù)不斷成熟，凍融胚胎復(fù)蘇率明顯提高，卵泡期高孕激素狀態(tài)下促排卵(PPOS)配合全胚冷凍作為一種新興方案，在國內(nèi)得到廣泛應(yīng)用。多篇文獻(xiàn)報(bào)道PPOS方案能夠有效抑制早發(fā)LH峰[3-4]，提高DOR患者的優(yōu)質(zhì)胚胎率[4-6]，改善多次移植失敗患者的卵母細(xì)胞與胚胎質(zhì)量[7]，能夠有效改善妊娠結(jié)局，可作為DOR患者或胚胎質(zhì)量不佳患者理想的促排卵方案選擇之一。然而，作為一種新的促排卵方案，其胚胎質(zhì)量的影響因素仍有待研究。因此，本研究回顧性分析我院行PPOS方案患者的臨床資料，分析影響胚胎數(shù)量與質(zhì)量的主要因素，為此方案進(jìn)一步的臨床應(yīng)用提供一定參考。

資料與方法

一、研究對象

回顧性分析2016年6月至2017年6月于武漢大學(xué)人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心就診，因卵巢功能減退或既往常規(guī)IVF促排卵方案胚胎質(zhì)量不佳而行PPOS方案促排卵助孕治療患者(共636例)的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合DOR診斷標(biāo)準(zhǔn)，即滿足以下任意2條即符合DOR診斷：(1)基礎(chǔ)FSH(bFSH)≥10 U/L或bFSH/bLH>3.6；(2)年齡>35歲；(3)自然周期下雙側(cè)卵巢中基礎(chǔ)竇卵泡計(jì)數(shù)(AFC)共≤5個(gè)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)夫妻雙方任意一方染色體異常；(2)甲狀腺功能異常等內(nèi)分泌系統(tǒng)異常疾病。

納入患者中有22例患者因未獲卵而取消周期。剩余的614例患者根據(jù)其卵裂期優(yōu)胚數(shù)目不同分為以下4組：0個(gè)組、1～2個(gè)組、3～4個(gè)組、≥5個(gè)組。

二、治療方案

1. PPOS：月經(jīng)周期第2天行陰道B超檢查及基礎(chǔ)性激素水平檢測評估患者卵巢的基本情況，當(dāng)日起每日口服醋酸甲羥孕酮(MPA，安宮黃體酮，浙江仙琚制藥)10 mg/d直至HCG日，同時(shí)每日肌肉注射尿促性素(HMG，樂寶得，珠海麗珠醫(yī)藥)150～300 U/d，每2～4 d行陰道超聲及性激素水平檢查評估卵泡發(fā)育情況，根據(jù)患者年齡、體重指數(shù)(BMI)、AFC及卵巢反應(yīng)情況調(diào)整Gn使用劑量。當(dāng)1個(gè)卵泡直徑≥20 mm或3個(gè)卵泡直徑≥17 mm時(shí)，肌肉注射人絨毛膜促性腺激素(HCG，珠海麗珠醫(yī)藥)10 000 U扳機(jī)。

2. 取卵、IVF與胚胎觀察：使用HCG扳機(jī)后34～36 h后在陰道超聲引導(dǎo)下取卵，依次抽取直徑大于10 mm的卵泡。根據(jù)男方精液情況、既往周期受精情況選擇IVF或ICSI方式人工授精。取卵后18 h評估受精情況，取卵后48 h、72 h評估胚胎情況。根據(jù)胚胎卵裂球大小、形態(tài)、碎片比例將胚胎分為4級：I級，胚胎卵裂球大小均勻，形態(tài)規(guī)則且胞質(zhì)清晰，無碎片或碎片比例小于10%；Ⅱ級，胚胎卵裂球大小不等，形態(tài)欠規(guī)則，碎片比例10%～26%；Ⅲ級，胚胎卵裂球大小不均等，碎片比例26%～50%；Ⅳ級，胚胎卵裂球大小嚴(yán)重不均勻，碎片比例大于50%。取卵后72 h形態(tài)評級為I級或Ⅱ級胚胎，提示胚胎質(zhì)量良好，定義為優(yōu)質(zhì)胚胎；評級為Ⅲ級以上胚胎為可移植胚胎[8]。PPOS方案患者體內(nèi)高孕激素影響子宮內(nèi)膜容受性，故取卵后72 h將所有可移植胚胎凍存，待日后行凍胚移植。

3. 觀察指標(biāo)：收集患者的臨床資料，包括患者年齡、不孕年限、BMI、既往IVF周期數(shù)、bFSH、bLH、bE2、AFC、Gn使用天數(shù)與總Gn使用量、HCG日E2水平、HCG日直徑>14 mm卵泡數(shù)目、獲卵數(shù)、2PN受精數(shù)、2PN受精率、2PN卵裂數(shù)、優(yōu)胚數(shù)等。

三、統(tǒng)計(jì)方法

結(jié) 果

一、入組患者的一般情況與促排卵結(jié)局比較

本研究共納入614例患者，其中0個(gè)優(yōu)胚組159例、1～2個(gè)組293例、3～4個(gè)組111例、≥5個(gè)組51例。4組患者的一般情況中年齡、BMI、既往IVF周期數(shù)、bLH、bE2組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，而不孕年限、bFSH、AFC在4組患者間比較存在顯著性差異(P<0.05)(表1)。

各組患者促排卵情況比較發(fā)現(xiàn)，Gn使用天數(shù)與總Gn使用量各組間比較無顯著性差異(P>0.05)，HCG日E2、HCG日≥14 mm卵泡數(shù)、獲卵數(shù)、2PN受精數(shù)、2PN受精率、2PN卵裂數(shù)4組患者間比較均有顯著性差異(P<0.05)；優(yōu)胚數(shù)≥5個(gè)組的HCG日≥14 mm卵泡數(shù)、獲卵數(shù)、2PN受精數(shù)及2PN卵裂數(shù)顯著高于其他各組(P<0.05)(表2)。

表1 四組患者一般情況比較(-±s)

注：4組間比較，*P<0.05；與優(yōu)胚數(shù)0個(gè)組比較，aP<0.05；與優(yōu)胚數(shù)1～2個(gè)組比較，bP<0.05；與優(yōu)胚數(shù)3～4個(gè)組比較，cP<0.05

表2 四組患者促排卵情況比較(-±s)

注：4組間比較，*P<0.05；4組間兩兩比較，#P<0.05；與優(yōu)胚數(shù)0個(gè)組比較，aP<0.05；與優(yōu)胚數(shù)1～2個(gè)組比較，bP<0.05

二、優(yōu)胚數(shù)影響因素分析

將上述一般情況與促排卵結(jié)局中有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的指標(biāo)：不孕年限、bFSH、AFC、HCG日E2、≥14 mm卵泡數(shù)、獲卵數(shù)、2PN受精數(shù)、2PN卵裂數(shù)納入線性回歸分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PPOS方案中患者優(yōu)胚數(shù)與獲卵數(shù)、AFC、HCG日E2、2PN卵裂數(shù)呈顯著線性相關(guān)(P<0.001)，是最好的回歸模型。表3為這一模型的偏回歸系數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)化偏回歸系數(shù)及對應(yīng)檢驗(yàn)值。

表3 胚胎影響因素線性回歸分析

注：*P<0.05

討 論

隨著輔助生殖技術(shù)快速發(fā)展，IVF-ET已逐漸被大眾接受并成為治療不孕癥患者的主要手段之一。COH作為IVF的重要組成部分，其效果與患者卵巢儲(chǔ)備功能、卵巢反應(yīng)性密切相關(guān)，獲得優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞與胚胎的數(shù)量將直接影響患者受孕機(jī)率。近年來女性生育年齡不斷推后，二胎政策全面開放，在接受IVF治療的不孕女性中DOR的比例明顯升高。DOR患者卵巢內(nèi)卵泡數(shù)目減少伴卵母細(xì)胞質(zhì)量下降，促排卵過程中表現(xiàn)為對Gn反應(yīng)差，卵母細(xì)胞與胚胎數(shù)目減少、質(zhì)量下降，早發(fā)LH峰增多，周期取消率升高等[9]。然而，現(xiàn)有治療僅能夠延緩此類患者卵巢衰竭的速度，暫無有效逆轉(zhuǎn)其卵巢功能的手段，因此保留患者殘存卵巢功能，盡早幫助其獲得妊娠顯得尤為重要。

在胚胎冷凍與凍融胚胎移植(FET)技術(shù)日益成熟的背景下，Kuang等[10]首次報(bào)道黃體期應(yīng)用HMG與來曲唑促排卵能有效減少早發(fā)LH峰，幫助卵巢功能正?；颊攉@得臨床妊娠。在此基礎(chǔ)上他們進(jìn)一步提出卵泡早期持續(xù)給予孕激素聯(lián)合HMG注射的PPOS方案[3]，在保證卵母細(xì)胞、胚胎質(zhì)量不受影響的同時(shí)，這一方案能夠減少給藥時(shí)間，減輕患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，快速得到了廣泛的臨床應(yīng)用[11]。多個(gè)臨床研究發(fā)現(xiàn)，PPOS方案較克羅米芬微刺激方案能夠有效抑制早發(fā)LH峰，增加DOR患者的優(yōu)胚率[6，12]，幫助患者獲得臨床妊娠，而較拮抗劑方案相比，PPOS方案優(yōu)胚率亦有提升[12]。也有學(xué)者對既往長方案移植失敗患者再次應(yīng)用PPOS方案的臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)雖然卵母細(xì)胞與胚胎數(shù)量減少，但通過FET可幫助患者獲得臨床妊娠[7]。因此，現(xiàn)今觀點(diǎn)認(rèn)為PPOS方案可能對卵母細(xì)胞與胚胎質(zhì)量有所改善，尤其對DOR患者或常規(guī)IVF方案妊娠結(jié)局不佳患者具有更大的潛在價(jià)值。

FSH水平檢測方便，且特異性高，臨床中該指標(biāo)常與年齡、AFC、抗苗勒管激素(AMH)等其他指標(biāo)聯(lián)合用于患者卵巢儲(chǔ)備功能的預(yù)測[13]。既往研究顯示FSH是體現(xiàn)卵泡數(shù)量的重要指標(biāo)[14-15]，對胚胎質(zhì)量影響能力有限[16]，其水平升高預(yù)示患者卵泡數(shù)量減少。而年齡則是預(yù)判患者卵巢功能、預(yù)測卵巢反應(yīng)性的又一重要因素，高齡往往預(yù)示卵泡數(shù)量下降伴有卵母細(xì)胞質(zhì)量的下降[17]。本研究中根據(jù)患者獲得優(yōu)胚數(shù)不同進(jìn)行分組，結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，4組患者間年齡無顯著性差異(P>0.05)，而優(yōu)胚數(shù)較少的患者AFC顯著降低，bFSH水平顯著升高(P<0.01)，我們推測PPOS方案中優(yōu)胚數(shù)減少主要源于患者卵泡數(shù)量的減少。同時(shí)我們觀察到優(yōu)胚數(shù)較少組別中患者AFC減少，HCG日E2水平降低，HCG日≥14 mm卵泡數(shù)與獲卵數(shù)減少(P<0.001)，這些改變均提示優(yōu)胚數(shù)與患者卵泡數(shù)目減少直接相關(guān)。通常學(xué)者認(rèn)為不孕年限長的患者卵母細(xì)胞與精子結(jié)合障礙更為嚴(yán)重[18]，本研究中優(yōu)胚數(shù)較少的患者不孕年限顯著增長(P<0.05)，進(jìn)一步比較4組患者受精率發(fā)現(xiàn)優(yōu)胚數(shù)較少組患者的卵母細(xì)胞受精率顯著下降(P<0.05)，因此，推測優(yōu)胚數(shù)減少與卵母細(xì)胞受精能力的降低也存在一定關(guān)聯(lián)。

最后我們通過逐步回歸分析發(fā)現(xiàn)，優(yōu)胚數(shù)與獲卵數(shù)、AFC、HCG日E2、2PN卵裂數(shù)呈顯著線性相關(guān)(P<0.001)，其中2PN卵裂數(shù)與優(yōu)胚數(shù)相關(guān)程度最大。盡管近年來許多學(xué)者認(rèn)為PPOS方案能夠明顯改善患者IVF的妊娠結(jié)局，但本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)患者優(yōu)胚數(shù)仍舊與患者卵泡數(shù)、獲卵數(shù)、受精數(shù)密切相關(guān)，因此DOR仍是制約患者獲得優(yōu)質(zhì)胚胎和理想妊娠結(jié)局的根本影響因素。

但因?yàn)楸狙芯繛榛仡櫺苑治鲅芯?，樣本量不大，分析結(jié)果可能存在一定偏差，因此需要大樣本、多中心、前瞻性隨機(jī)對照研究，進(jìn)一步完成對PPOS方案胚胎影響因素的分析。同時(shí)，在資料整理過程中發(fā)現(xiàn)，PPOS進(jìn)入臨床應(yīng)用較晚，且本研究中多數(shù)DOR患者可能需經(jīng)多個(gè)周期積攢胚胎，因此優(yōu)胚數(shù)較少患者大多尚未完成移植，因此本研究中缺少妊娠相關(guān)情況分析。我們將在接下來的研究中繼續(xù)追蹤隨訪，完成后續(xù)妊娠情況統(tǒng)計(jì)。

綜上所述，盡管以往研究發(fā)現(xiàn)PPOS方案能夠改善患者的促排卵效果，可作為DOR患者有效的促排卵方案，但PPOS方案中卵巢儲(chǔ)備功能仍是影響其獲得優(yōu)質(zhì)胚胎的最重要的影響因素。因此，及時(shí)幫助患者在卵巢衰竭前的有限周期中獲取胚胎，及時(shí)挽救患者生育力仍是生殖領(lǐng)域研究的重點(diǎn)之一。