俞珍惜 沈劍 黃先玫 李小莉 劉占利 蔣春明

氣道平滑肌細(xì)胞（ASMCs）在哮喘的病理生理過程中發(fā)揮著重要作用，其生理功能受到細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度（[Ca2+] i）的影響，[Ca2+] i的變化與哮喘氣道高反應(yīng)性（AHR）有關(guān)[1]。肌漿/內(nèi)質(zhì)網(wǎng) Ca2+-ATP 酶（SERCA）介導(dǎo)的肌漿網(wǎng)（SR）鈣攝取儲存是調(diào)控[Ca2+] i穩(wěn)定的重要機制，SERCA活性下降所導(dǎo)致的SR鈣攝取儲存功能受損可能顯著影響鈣依賴的平滑肌功能[2]。哺乳動物3個SERCA家族成員中的SERCA2在平滑肌中高度表達(dá)[3]。IL－8作為CXC趨化因子家族的一員，可趨化中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞向炎癥、損傷及感染部位遷移，引發(fā)呼吸爆發(fā)，超氧負(fù)離子和過氧化氫釋放。Digiovine等[4]證實在移植后閉塞性細(xì)支氣管炎患者中，ASMCs是IL－8的最重要來源。但目前導(dǎo)致ASMCs分泌IL－8異常的機制仍未探明。

Pang等[5]發(fā)現(xiàn)緩激肽（BK）以濃度和時間依賴的方式增強ASMCs的IL－8釋放，由于BK是SERCA2的抑制劑，本實驗假設(shè)哮喘ASMCs中IL－8分泌亢進(jìn)可能與SERCA2表達(dá)減少有關(guān)，通過從正常大鼠和經(jīng)卵清蛋白（OVA）誘導(dǎo)的哮喘大鼠分離原代ASMCs，檢測SERCA2表達(dá)、[Ca2+] i和IL－8水平，并利用siRNA技術(shù)下調(diào)SERCA2，探討哮喘ASMCs中SERCA2表達(dá)與IL－8分泌的關(guān)系，旨在為研究哮喘ASMCs的細(xì)胞炎癥機制提供一定的實驗依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及材料 SPF級SD雄性大鼠30只，體重120～160g，6～8周齡，由上海斯萊克實驗動物中心提供。主要材料試劑如下：OVA、BK、吡咯烷二硫氨基甲酸（PDTC）及毒胡蘿卜素（TSG）均購于美國Sigma公司，D－MEM培養(yǎng)基、牛血清蛋白（BSA）、RIPA緩沖液均購于美國Thermo公司，胎牛血清（PBS）購于美國Invitrogen公司，抗α－平滑肌肌動蛋白（α－actin）單克隆抗體購于美國DakoCytomation公司，Dharma FECT2 siRNA轉(zhuǎn)染試劑盒、SERCA2 siRNAs及錯義序列siRNA均購于美國Dharmacon公司，RNeasy mini試劑盒購于德國Qiagen公司，GoScriptTM逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)購于美國Promega公司，SYBR?Premix Ex TaqTM購于日本TaKaRa公司，PVDF膜及核蛋白提取試劑盒購于美國Millpore公司，F(xiàn)ura PE－3/AM購于美國Santa cruz公司，ECL試劑盒購于英國Amersham公司，大鼠重組IL－17購于美國R＆D公司，IL－8 ELISA試劑盒購于比利時Biosource SA公司，單抗 SERCA2（ab137020）及單抗 GAPDH（ab181603）購于英國 Abcam公司，單抗IP3R1（NBP1－95155）購于美國Novus公司，BCA蛋白定量試劑盒及HRP－偶聯(lián)二抗購于上海碧云天生物科技有限公司，單抗IκBα（9242）、單抗 NF－κB p65（4764）及單抗 β－actin（4970）均購于美國Cell Signaling Technology公司，SERCA2、三磷酸肌醇受體（IP3R1）、IL－8和 β－actin引物自行設(shè)計后由上海生工公司合成。

1.2 方法

1.2.1 大鼠哮喘模型構(gòu)建及處理 按照隨機數(shù)字表法將30只大鼠分成哮喘1組、哮喘2組和正常組，每組10只。哮喘模型制作參照文獻(xiàn)[6] 略作調(diào)整，哮喘1組和哮喘2組：第1天和第8天將1ml含1mg OVA和100mg氫氧化鋁混合液進(jìn)行腹腔注射致敏，在第17～21天分別用1%和2%OVA鹽水經(jīng)空氣壓縮霧化器每日霧化吸入30min。正常組：用生理鹽水進(jìn)行相同的處理。所有大鼠在第23天處死。

1.2.2 原代大鼠ASMCs分離和培養(yǎng) 取出氣管組織放入預(yù)冷無菌磷酸緩沖液PBS中，去除內(nèi)外膜及軟骨，剩余平滑肌組織置入37℃含2mg/ml BSA、2mg/mlⅠ型膠原酶和20U/mlⅣ型彈力蛋白酶的緩沖液中消化1h。將得到的細(xì)胞混懸液離心，去除碎片，并在含L－谷氨酰胺（2mM）、青霉素（100U/ml）、鏈霉素（100μg/ml）、兩性霉素 B（1.25μg/ml）和 10%FBS的 D－MEM 培養(yǎng)基中再混懸，置于37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)。本實驗所用的原代細(xì)胞經(jīng)抗α－actin染色鑒定顯示＞95%。

1.2.4 qRT－PCR測定mRNA表達(dá) 利用RNeasy迷你試劑盒從約1×106個細(xì)胞裂解液中提取總RNA，采用GoScriptTM逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)獲得cDNA，然后根據(jù)SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒說明進(jìn)行PCR定量檢測，使用引物序列如下：SERCA2，上游：5′－CCC TGT ACA GTT TGC TTA－3′，下游：5′－GCT GTG AGG AAC TGA ACC－3′；IP3R1，上游：5′－AGC CAT GTT AGA GGC TCA CAC GTT－3′，下游：5′－CCT GGG AGA TGA CAC TGA CTG GT－3′；IL－8，上游：5′－GAG CAA CCC ATA CCC ATC GA－3′，下游：5′－TGG TCC CAC CAT ATC TTC TTA ATC T－3′；β－actin，上游：5′－TGG CCT CAC TGT CCA CCT TCC A－3′，下游：5′－CGC AGC TCA GTA ACA GTC CGC C-3′。β-actin作為內(nèi)參，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性15min，94℃變性 15s，56℃退火 20s，72℃延伸 20s，共 45個循環(huán)。反應(yīng)系統(tǒng)按照廠商建議構(gòu)建，利用2-ΔΔCt法計算相對基因表達(dá)量。每組實驗重復(fù)3次。

1.2.5 Western blotting測定蛋白含量 將細(xì)胞裂解于含蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA緩沖液，再利用核蛋白提取試劑盒收集總蛋白，利用BCA蛋白定量試劑盒對獲得的總蛋白濃度檢測后進(jìn)行電泳并將其轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用含5%脫脂乳Tris緩沖液進(jìn)行封閉1h，分別加入兔抗 SERCA2、IP3R1、IκBα、NF-κB p65、β-actin（濃度 1∶1 000）或 GAPDH（濃度 1∶10 000），4℃過夜，再加入 HRP-偶聯(lián)二抗（濃度 1∶3 000），室溫孵育 1h，利用ECL試劑盒顯現(xiàn)印記，蛋白帶光密度由Image J軟件進(jìn)行定量。

1.2.6 Fura PE-3/AM測定[Ca2+] i 用1μM BK刺激ASMCs誘導(dǎo)SR鈣釋放，參照文獻(xiàn)[8] ，將蓋玻片上的ASMCs（約1×103/片）在加有0.5μM鈣離子熒光指示劑Fura PE-3/AM的Hepes緩沖生理鹽水中避光室溫孵育90min，置于倒置顯微鏡下選好測定的細(xì)胞，以510nm為發(fā)射波長，以340 nm和380 nm為激發(fā)波長進(jìn)行測定，負(fù)載Fura PE-3/AM細(xì)胞的熒光比值（R340/380）用于表示[Ca2+] i。

1.2.7 ELISA法測定IL-8水平 從正?；蛳笫蠓蛛x得到的ASMCs，經(jīng)SERCA2 siRNA或錯義序列siRNA轉(zhuǎn)染，通過Western blotting確定SERCA2是否被下調(diào)后，置于含或不含10μM PDTC、含或不含0.1ng/ml重組大鼠IL-17的37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)[9]，24h后收集上清液，利用ELISA試劑盒檢測IL-8水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用GraphPad統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，組間兩兩比較采用Student’st檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組SERCA2和IP3R1表達(dá)的比較 見表1。

表1 各組SERCA2和IP3R1表達(dá)的比較

由表1可見，與正常組相比，哮喘組SERCA2 mRNA及蛋白表達(dá)均減少（P＜0.05或0.01），哮喘2組減少則更顯著（均P＜0.01），而哮喘組IP3R1 mRNA及蛋白的表達(dá)與正常組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

2.2 各組[Ca2+] i的比較 見圖1。

20世紀(jì)80年代，全球化進(jìn)程進(jìn)一步加快，世界各國間的交流日益頻繁，許多翻譯學(xué)者逐漸擺脫翻譯研究的局限性，開始對翻譯進(jìn)行多角度宏觀研究，大大拓展了翻譯研究的內(nèi)涵和外延意義。操控理論便是在此背景下形成和發(fā)展起來的。

圖1 各組[Ca2+] i的比較（a：經(jīng)BK誘導(dǎo)后的鈣瞬變峰值水平；b：鈣峰恢復(fù)至基線所需時間；與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01）

由圖1可見，與正常組比較，哮喘組對BK誘導(dǎo)的鈣瞬變峰值下降（P＜0.05或0.01）；哮喘2組需要更長時間重新攝取鈣使[Ca2+] i恢復(fù)至基線水平（P＜0.01）。

2.3 各組IL-8 mRNA表達(dá)和分泌的比較 見表2。

由表2可見，哮喘組IL-8 mRNA基礎(chǔ)值和經(jīng)IL-17刺激后的誘導(dǎo)值均較正常組增加（P＜0.05或0.01），IL-8的分泌顯著增加（均P＜0.01）。

表2 各組IL-8 mRNA表達(dá)和分泌的比較

2.4 經(jīng)siRNA轉(zhuǎn)染后各組IL-8 mRNA表達(dá)和分泌的比較 見圖2、表3。

圖2 明確基因下調(diào)組中SERCA2基因被下調(diào)（與陰性對照組及正常對照組比較，**P＜0.01）

表3 經(jīng)siRNA轉(zhuǎn)染后各組IL-8 mRNA表達(dá)和分泌的比較

由圖2、表3可見，在明確SERCA2基因被下調(diào)后，無論有無IL-17刺激，基因下調(diào)組IL-8 mRNA表達(dá)和分泌均顯著增加（均P＜0.01），而與哮喘對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

2.5 各組NF-κB的活化及改變 見圖3。

由圖3可見，哮喘組IκBα磷酸化和NF-κB p65核轉(zhuǎn)位較正常組均增加（P＜0.05或0.01），基因下調(diào)組和TSG抑制組的NF-κB p65核轉(zhuǎn)位亦增加（P＜0.05或0.01）。

2.6 經(jīng)PDTC處理后各組IL-8 mRNA表達(dá)和分泌的比較 見表4。

由表4可見，基因下調(diào)組、哮喘對照組和正常對照組在IL-17刺激下，經(jīng)PDTC處理后，IL-8 mRNA表達(dá)和分泌均減少（P＜0.05或0.01）。

圖3 各組NF-κB的活化及改變（a：各組NF-κB的活化，包括IκBα磷酸化和NF-κB p65核轉(zhuǎn)位；b：基因下調(diào)組和TSG抑制組NF-κB p65核轉(zhuǎn)位的改變；與正常組及陰性對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01）

3 討論

ASMCs的生物活性是通過[Ca2+] i變化來完成的[10]。[Ca2+] i升高導(dǎo)致細(xì)胞膜Ca2+通道和鈉/鈣交換（NCX）的活化，促進(jìn)鈣內(nèi)流，進(jìn)而引發(fā)IP3R或蘭尼受體（RyR）介導(dǎo)的SR進(jìn)一步釋放儲存鈣，細(xì)胞內(nèi)鈣信號的終止主要通過NCX和細(xì)胞膜Ca2+-ATP酶（PMCA）使細(xì)胞外鈣濃度下降，以及SERCA快速攝取鈣至SR儲存使[Ca2+] i恢復(fù)正常來調(diào)控[11]。Mahn等[8]研究發(fā)現(xiàn)，哮喘患者ASMCs的SERCA2表達(dá)減少，經(jīng)BK誘導(dǎo)后的[Ca2+] i峰值較正常人減弱，并且在恢復(fù)基線水平能力被延遲了大約50%，由于內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)恢復(fù)能力下降引起的[Ca2+] i持續(xù)增高，導(dǎo)致細(xì)胞增殖和分泌功能增強，而通過siRNA技術(shù)下調(diào)正常人群來源的ASMCs中SERCA2基因表達(dá)，可呈現(xiàn)類似哮喘ASMCs的擴展、增殖和eotaxin-1釋放增強，因而認(rèn)為在哮喘患者ASMCs中SERCA2表達(dá)缺陷可導(dǎo)致細(xì)胞高分泌和高增殖表型，ASMCs鈣調(diào)控異常可能在氣道重塑中有重要作用。本實驗發(fā)現(xiàn)，哮喘組SERCA2的轉(zhuǎn)錄和翻譯均減少，且與病情嚴(yán)重程度相關(guān)?；贗P3R為SR上的一種鈣釋放通道，正常組和哮喘組IP3R1的表達(dá)并無差異，提示哮喘大鼠SERCA2的異常改變并不是因為在總SR數(shù)量上的減少[8]。另外，哮喘組對BK誘導(dǎo)的鈣瞬變峰值下降，鈣峰恢復(fù)至基線水平所需的時間亦更長，提示哮喘大鼠ASMCs中SR的鈣儲存及再攝取功能受損，SERCA2在哮喘大鼠ASMCs鈣穩(wěn)態(tài)失衡中發(fā)揮著重要的作用。

表4 經(jīng)PDTC處理后各組IL-8 mRNA表達(dá)和分泌的比較

哮喘的發(fā)生、發(fā)展由龐大的細(xì)胞因子群參與，其中IL-8是目前已知活性最強的中性粒細(xì)胞趨化因子。Hosoki等[12]在對BALF中48種細(xì)胞因子的分析中發(fā)現(xiàn)，中性粒細(xì)胞和IL-8是唯一能區(qū)分控制性哮喘和未控制性哮喘的炎性成分。IL-8可能通過特定的CXC受體激活A(yù)SMCs引起其收縮和遷移，導(dǎo)致氣道過度狹窄和重塑[13]。本實驗發(fā)現(xiàn)，哮喘組IL-8的基礎(chǔ)值及經(jīng)IL-17刺激后的誘導(dǎo)值均較正常組增加，而基因下調(diào)組IL-8的mRNA表達(dá)和分泌亦顯著增加，類似哮喘組中IL-8的變化，因此認(rèn)為哮喘大鼠ASMCs中SERCA2表達(dá)的減少可導(dǎo)致IL-8分泌亢進(jìn)。

細(xì)胞內(nèi)Ca2+作為重要的第二信使具有一種特殊的運動形式，即鈣振蕩，是Ca2+在細(xì)胞膜兩側(cè)和細(xì)胞器膜兩側(cè)的運轉(zhuǎn)共同形成的[14]。吸入β受體激動劑即是通過降低ASMCs鈣振蕩波幅來緩解平滑肌的痙攣[15]。既往研究表明細(xì)胞內(nèi)鈣調(diào)節(jié)與NF-κB活化和炎癥信號反應(yīng)有關(guān)[16]。NF-κB作為一種核轉(zhuǎn)錄因子，廣泛參與免疫應(yīng)答及炎癥反應(yīng)，致敏原、臭氧、病毒感染等哮喘誘發(fā)因素均可刺激NF-κB活化，且糖皮質(zhì)激素作為哮喘主要控制藥物則是NF-κB活化的有效阻滯劑[17]。哮喘患者氣道中NF-κB活化明顯高于正常，在抑制細(xì)胞的NF-κB活化后，氣道炎癥明顯減輕，相關(guān)炎性因子表達(dá)亦下調(diào)[18]。鎳離子作為一種廣譜Ca2+通道阻滯劑可減少Ca2+內(nèi)流，能消除人ASMCs中CD-40誘導(dǎo)的NF-κB活化[19]。本實驗發(fā)現(xiàn)，哮喘組NF-κB活化較正常組增加，正常ASMCs經(jīng)SERCA2基因下調(diào)或者利用TSG抑制SERCA2功能后均可促進(jìn)NF-κB活化，提示ASMCs中SERCA2表達(dá)或功能不足時可影響NF-κB的活化。在應(yīng)用NF-κB活化的特異性抑制劑PDTC后[20]，無論SERCA2表達(dá)或功能是否受損，IL-17刺激誘導(dǎo)后IL-8 mRNA表達(dá)和分泌均減少，因此推測在哮喘大鼠ASMCs中因SERCA2表達(dá)的減少導(dǎo)致了鈣振蕩的改變，使NF-κB活化增強，經(jīng)IL-17介導(dǎo)使得IL-8的產(chǎn)生增加。綜上所述，哮喘大鼠ASMCs中SERCA2的不足，可導(dǎo)致鈣穩(wěn)態(tài)的改變，可能通過增強的NF-κB活性介導(dǎo)IL-8分泌亢進(jìn)，進(jìn)而加重哮喘氣道炎癥及重塑，SERCA2也許可能作為一個哮喘防治的新靶點。