楊子祥 蘇銀玲 白明第 劉海剛 木萬福 段元杰 楊玉皎 方海東

(云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱區(qū)生態(tài)農(nóng)業(yè)研究所/元謀干熱河谷植物園 云南元謀 651300)

芒果是著名的熱帶水果之一，也是云南熱區(qū)的支柱產(chǎn)業(yè)之一[1]。云南芒果適栽區(qū)大都分布于金沙江、元江、怒江、南盤江等沿江的低海拔干熱河谷地區(qū)，氣候干熱、少雨，陽光充足，氣溫高，晝夜溫差大，小環(huán)境類型多，芒果品種多樣、品質(zhì)優(yōu)良，口味佳，深受人們喜愛[2]。但近年來，隨著芒果栽培面積的不斷擴(kuò)大，其病害問題日益突出，嚴(yán)重影響了芒果的產(chǎn)量和品質(zhì)。其中，由膠孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)引起的芒果炭疽病已發(fā)展為區(qū)域種植中的重要病害之一[3-6]。芒果炭疽病具有潛伏侵染性，主要危害果實(shí)，是果實(shí)采收后危害最嚴(yán)重的病害之一，占果實(shí)病害總量的70%以上，常引起貯運(yùn)期的果實(shí)腐爛，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[7]。目前，國內(nèi)外對芒果的研究多集中于芒果的栽培、新品種的選育、病害的識(shí)別和防治等方面，但對芒果炭疽病病原真菌的生物學(xué)特性研究甚少。因此，本研究采用菌絲生長速率法、血球計(jì)數(shù)板法，就不同環(huán)境條件對膠孢炭疽菌菌絲生長和孢子形成的影響開展研究，以期對芒果炭疽病的綜合防治提出相對合理、 科學(xué)的防控措施，為進(jìn)一步推進(jìn)云南芒果產(chǎn)業(yè)的持續(xù)、快速發(fā)展奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株膠孢炭疽菌(C.gloeosporioides)，采自云南干熱河谷地區(qū)芒果園炭疽病病葉，經(jīng)分離獲純化后，于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｅ囵B(yǎng)基采用馬鈴薯瓊脂葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)，其中馬鈴薯200 g、葡萄糖17～20 g、瓊脂15～20 g、蒸餾水1 000 mL[8]。

1.2 方法[9-12]

1.2.1 溫度對芒果炭疽病菌菌絲生長和孢子形成的影響

挑取菌齡一致，直徑為7 mm的菌餅接種于PDA平板中央，分別置于5、10、15、20、25、30、35和40℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，每處理3次重復(fù)，6 d后采用十字交叉法測量菌落直徑，10 d后每個(gè)培養(yǎng)皿加入10 mL無菌水洗下孢子，在顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板法測定各梯度產(chǎn)孢量。

1.2.2 光照對芒果炭疽病菌菌絲生長和孢子形成的影響

挑取菌齡一致，直徑為7 mm的菌餅接種于PDA平板中央，分別置于12 h光照/12 h黑暗、24 h全光照、24 h全黑暗的條件下，26℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，其余方法同1.2.1。

1.2.3 pH值對芒果炭疽病菌菌絲生長和孢子形成的影響

用1 mol/L的NaOH和0.1 mol/L HCl調(diào)節(jié)滅菌后PDA培養(yǎng)基，制成pH值分別為2、3、4、5、6、7、8、9、10和11的培養(yǎng)基。將菌齡一致，直徑為7 mm的菌餅接種于各pH值PDA平板中央，26℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，其余方法同1.2.1。

1.2.4 不同碳源對芒果炭疽病菌菌絲生長和孢子形成的影響

以查氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)，分別用等摩爾碳量的淀粉、甘油、蔗糖、麥芽糖、果糖和甘露醇替代蔗糖，以無碳源培養(yǎng)基為對照，將菌齡一致，直徑為7 mm的菌餅移入含有不同碳源培養(yǎng)基上，26℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，其余方法同1.2.1。

1.2.5 不同氮源對芒果炭疽病菌菌絲生長和孢子形成的影響

以查氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)，分別用等摩爾氮量的硝酸鉀、硝酸鈉、硫酸銨、氯化銨、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏和尿素替代硝酸鈉，以無氮源培養(yǎng)基為對照，將菌齡一致，直徑為7 mm的菌餅移入含有不同氮源培養(yǎng)基上，26℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，其余方法同1.2.1。

1.2.6 菌絲和分生孢子致死溫度測定

取10 mL菌絲體懸浮液或10 mL孢子懸浮液(400倍鏡下50～100個(gè)孢子/視野)于滅菌試管中，置于40、45、 50、 51、 52、 53、 54、 55、 56、 57、 58、 59 和60℃的恒溫水浴鍋中，處理10 min后迅速冷卻。將菌絲體懸浮液或孢子懸浮液涂于PDA平板上培養(yǎng)，6 d后觀察菌絲、菌落生長狀況。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用Excel 2007和DPS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，采用Duncan's法進(jìn)行比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對芒果炭疽病菌菌絲生長和孢子形成的影響

由圖1可知，在10～25℃內(nèi)菌絲生長速率隨著溫度升高而增大，25℃時(shí)菌落直徑達(dá)80.80 mm，在30℃時(shí)，菌絲生長速率下降，40℃時(shí)停止生長；病原菌產(chǎn)孢量在10～25℃時(shí)逐漸升高，25℃時(shí)的產(chǎn)孢量最大，為102.40×106個(gè)/mL。說明芒果炭疽菌菌絲生長和孢子形成的溫度均為10～35℃，適溫分別為15～25℃及20～25℃。相對而言，分生孢子形成的最適溫度略高于菌絲生長的最適溫度。

2.2 光照對芒果炭疽病菌菌絲生長和孢子形成的影響

圖1 不同溫度對病原菌菌絲生長及產(chǎn)孢的影響

芒果炭疽病菌在不同光照條件下均能生長，光照可促進(jìn)芒果炭疽菌的菌絲生長，其中24 h全光照菌落直徑最大，達(dá)79.70 mm，12 h光照/12 h黑暗次之。光照對該菌孢子的形成有顯著促進(jìn)作用，其中，以12 h光照/12 h黑暗促進(jìn)作用最明顯，102.60×106個(gè)/mL(表1)。此外，光暗交替處理的菌落還會(huì)出現(xiàn)粉紅色與灰白色菌絲相間構(gòu)成同心輪紋。

表1 不同光照對菌絲生長及產(chǎn)孢的影響

2.3 pH值對芒果炭疽病菌菌絲生長和孢子形成的影響

圖2表明，在不同pH值PDA培養(yǎng)基上芒果炭疽病菌菌絲能在較寬的pH值范圍內(nèi)生長。在pH為4～8時(shí)，菌絲生長速率逐漸增快，pH為7時(shí)菌落最大，直徑達(dá)80.70 mm，之后隨著pH升高，菌絲生長速率下降，當(dāng)pH為2時(shí)菌絲不能生長。芒果炭疽病病原菌在pH 3～10的范圍內(nèi)均能形成分生孢子，分生孢子形成最佳pH值為4，此時(shí)孢子量高達(dá)860.00×106個(gè)孢子/mL，之后隨著pH升高，產(chǎn)孢量下降。上述結(jié)果表明，偏酸性至中性條件有利于芒果炭疽病菌菌絲生長，且在酸性條件下有利于分生孢子形成。

2.4 不同碳、氮源對芒果炭疽病菌菌絲生長和孢子形成的影響

由表2可知，芒果炭疽病菌對麥芽糖的利用率最高，培養(yǎng)6 d后菌落直徑達(dá)80.00 mm；在無碳源的培養(yǎng)基上菌絲雖然生長較快，但菌絲稀疏，病原菌對其它碳源利用高低依次為淀粉＞蔗糖＞甘油＞甘露醇＞果糖。麥芽糖為碳源的培養(yǎng)基上，不僅菌絲生長迅速、孢子形成量也最高，為48.20×106個(gè)/mL，而甘露醇不利于該菌產(chǎn)孢，僅為5.40×106個(gè)/mL。

從表3可知，牛肉膏為芒果炭疽病菌適宜氮源，培養(yǎng)6 d后菌落直徑達(dá)83.50 mm，極顯著高于其它氮源處理的菌落大小；菌絲在硫酸銨和尿素為氮源的培養(yǎng)基上生長速度緩慢，菌落直徑均為25.67 mm；說明病菌對氮源利用高低依次是牛肉膏＞蛋白胨＞酵母膏＞硝酸鈉＞硝酸鉀＞硫酸銨＝尿素。牛肉膏為碳源對孢子的形成較好，硝酸鉀、硫酸銨對孢子的形成相對較差，蛋白胨和尿素為氮源不產(chǎn)生孢子不利于產(chǎn)孢。

圖2 不同pH對病原菌菌絲生長及產(chǎn)孢的影響

表2 不同碳源對菌絲生長及分生孢子形成的影響

表3 不同氮源對菌絲生長和孢子形成的影響

2.5 菌絲和分生孢子致死溫度測定

試驗(yàn)中通過設(shè)置不同溫度梯度，測定了芒果炭疽病菌絲和分生孢子的致死溫度。結(jié)果表明，芒果炭疽病菌絲致死溫度為56℃，10 min；分生孢子的致死溫度為51℃，10 min(表4)。

表4 菌絲和分生孢子的致死溫度

3 討論

云南干熱河谷地區(qū)芒果生產(chǎn)中炭疽病嚴(yán)重危害葉片和果實(shí)，特別是在芒果果實(shí)生長期間普遍存在著炭疽病菌的潛伏侵染，而且?guī)Ь矢摺１狙芯烤筒煌瑴囟?、光照、pH值、營養(yǎng)等環(huán)境因素對芒果炭疽病菌菌絲生長和孢子形成的影響進(jìn)行了對比分析。初步研究表明，芒果炭疽病菌10～35℃范圍內(nèi)均可生長，其菌絲生長和孢子形成的最適溫度為25℃，在20℃以下或30℃以上該菌菌絲生長速度和產(chǎn)孢量明顯減少，分生孢子形成的最適溫度略高于菌絲生長的最適溫度。這些特性與芒果炭疽病每年在田間的消長規(guī)律關(guān)系密切。云南干熱河谷地區(qū)芒果炭疽病在1年內(nèi)有多個(gè)發(fā)病高峰，一般年份春、夏梢發(fā)病重，秋梢發(fā)病輕。但如果8月遇陰雨天氣，則可能發(fā)生第3次高峰期，秋梢也會(huì)嚴(yán)重感病。芒果炭疽病菌對酸堿度的適應(yīng)能力強(qiáng)，pH為3～10的范圍內(nèi)菌絲均能生長和產(chǎn)孢，病菌絲生長最佳pH為7，分生孢子形成最佳pH值為4，說明偏酸性至中性條件有利于病菌菌絲生長，在酸性條件下有利于分生孢子形成。這與黃思良等[13]對芒果炭疽病菌的生物學(xué)特性的研究結(jié)果基本一致，但略有差異，這可能與寄主及病原菌生長環(huán)境差異有關(guān)。24 h光照條件下有利于菌絲生長，而12 h光照/12 h黑暗可促進(jìn)其產(chǎn)孢，與劉愛媛等[14]對荔枝膠孢炭疽菌的研究結(jié)果之間有一定差異，這可能與炭疽病菌在不同種類植物上寄生或變異有關(guān)，需要進(jìn)一步研究證實(shí)。以麥芽糖為碳源和以牛肉膏為氮源時(shí)病原菌菌絲生長最快、產(chǎn)孢量最大，說明芒果炭疽病菌的生長需要碳氮源。芒果炭疽病菌菌絲對高溫的耐受能力比分生孢子強(qiáng)，病菌絲致死溫度為56℃，10 min；分生孢子的致死溫度為51℃，10 min。本研究結(jié)果可為在芒果果實(shí)上應(yīng)用熱處理措施控制炭疽病選擇處理溫度和時(shí)間提供參考。關(guān)于不同的熱處理方法、溫度、時(shí)間對芒果果皮中炭疽病菌活力的抑制作用還需進(jìn)一步研究[15]。因此，在芒果炭疽病蔓延時(shí)期，防治時(shí)要采取不同措施，錯(cuò)開病原菌生長發(fā)育的最適環(huán)境條件防止芒果炭疽病的發(fā)生，如選擇高地建園，溝系暢通，科學(xué)施肥，合理修剪，改善果園土壤環(huán)境等。

近年來，由于芒果種植效益突出，管理較其他水果簡單，農(nóng)民種植芒果的積極性比較高，種植區(qū)域不斷擴(kuò)大，接踵而來的病害日益蔓延，越發(fā)嚴(yán)重。因此，本研究為芒果炭疽病菌分子生物學(xué)、病原學(xué)、病理學(xué)的新發(fā)現(xiàn)提供理論基礎(chǔ)，對今后該病的發(fā)生與防治有著深刻的指導(dǎo)和現(xiàn)實(shí)意義，為芒果炭疽病防治提供理論依據(jù)。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，本試驗(yàn)運(yùn)用傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行研究，可能存在很多方面的不足，所以，今后對該病原菌的生物學(xué)特性和致病機(jī)理等方面的問題，應(yīng)采用分子生物學(xué)的方法作進(jìn)一步的試驗(yàn)研究，以便促進(jìn)芒果產(chǎn)業(yè)綠色無公害的快速發(fā)展。