陳永忠，陳 慧，林秀明，陳 成

（福建中醫(yī)藥大學附屬第二人民醫(yī)院，福建 福州 350003）

內(nèi)皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）是外周循環(huán)中內(nèi)皮細胞的前體細胞，具有內(nèi)皮再生能力，可以黏附于血管內(nèi)皮損傷處，分化為成熟的內(nèi)皮細胞，參與血管損傷修復，多種因素可促進EPCs的衰老和細胞凋亡［1］。端粒是位于真核細胞染色體末端的一段DNA-蛋白質復合體，細胞的每一次分裂，均會出現(xiàn)染色體末端DNA片段的丟失，端粒像一頂“帽子”保護著染色體DNA的完整和穩(wěn)定，當端?？s短到一定程度就會出現(xiàn)染色體DNA損傷，從而引發(fā)細胞衰老、凋亡［2］。端粒酶是一種能延長端粒末端的逆轉錄酶，主要由端粒酶RNA（TERC）和端粒酶逆轉錄酶（TERT）組成。端粒酶以自身RNA為模版，在端粒末端合成新的DNA重復序列，以補償細胞分裂時端粒的縮短。因此，端粒酶活性是調(diào)控細胞衰老和凋亡的關鍵點。有研究發(fā)現(xiàn)丹參多酚酸鹽能抑制EPCs的衰老和凋亡［3］，但其中的機制尚不明確。本研究基于端粒酶活性探討丹參多酚酸鹽調(diào)控內(nèi)皮祖細胞衰老的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑 丹參多酚酸鹽（上海綠谷制藥有限公司，批號18040322）；乙?；兔芏戎鞍祝―ilacLDL）、FITC 標記的荊豆凝集素-I（FITC-UEA-I）（美國Sigma公司）；EGM-2培養(yǎng)基、磷酸緩沖鹽溶液、淋巴細胞分離液、SA-β半乳糖苷酶染色試劑盒、冷丙酮、EDTA、Tris、dNTP、寡聚核苷酸（杭州格唯科技有限公司）；dATP、dGTP、TaqDNA 聚合酶（美國Promega公司）。

1.2 實驗儀器 流式細胞儀（Beckman-Coulter公司）；顯微鏡（Olympus公司）；二氧化碳細胞培養(yǎng)箱（Panasonic公司）。

1.3 人外周血EPCs的分離和培養(yǎng) 取健康成人外周靜脈血50 mL，每毫升血以0.1 mg肝素抗凝。血液樣本用磷酸緩沖鹽溶液進行等倍稀釋，加入淋巴細胞分離液后以2 000 r／min離心20 min，吸取血漿與分離液交界處的白色細胞層，加入磷酸緩沖鹽溶液洗滌2次，接種于纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)板上，加入EGM-2培養(yǎng)液，在恒定溫度37℃、二氧化碳濃度5%、飽和濕度95%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d換液1次，用倒置相差顯微鏡觀察貼壁細胞。第10天收集培養(yǎng)瓶中貼壁生長的梭形細胞進行鑒定。

1.4 EPCs鑒定 收集細胞后加入10 μg／mL的DiL-acLDL，在恒定溫度 37℃、二氧化碳濃度5%、飽和濕度95%的培養(yǎng)箱孵育4 h后，室溫下冷丙酮固定8 min，用磷酸緩沖鹽溶液漂洗2次，加入10 μg／mL的FITC-UEA-1室溫下孵育1 h。共聚焦顯微鏡下DiL-acLDL和FITC-UEA-1雙染色陽性的細胞鑒定為正在分化的EPCs。

1.5 分組和干預 將培養(yǎng)14 d所得的EPCs隨機分成4組：對照組、低濃度組（丹參多酚酸鹽1 mg／L）、中濃度組（丹參多酚酸鹽5 mg／L）、高濃度組（丹參多酚酸鹽 10 mg／L），在 37 ℃、5%CO2、95%飽和濕度的培養(yǎng)箱中加藥共培養(yǎng)。

1.6 檢測EPCs增殖能力 將干預24 h后的EPCs接種于包被有纖維連接蛋白的96孔培養(yǎng)板中，每孔加入 10 μL MTT（5 g／L）培養(yǎng) 4 h，吸除上清液后每孔加入150 μL二甲基亞砜，振蕩 10 min后置酶標儀上，于波長490 nm處測各孔光吸收度值（A490），了解 EPCs的增殖能力。

1.7 檢測EPCs黏附能力 用0.25 g／L胰蛋白酶消化收集干預24 h后的EPCs，懸浮在500 μL培養(yǎng)液中吹打均勻并計數(shù)，然后將同等數(shù)目的EPCs接種在包被有明膠的培養(yǎng)板，在恒定溫度37℃、5%CO2、飽和濕度95%的培養(yǎng)箱培養(yǎng)30 min，取3個高倍鏡視野（×200）計數(shù)貼壁細胞，了解EPCs的黏附能力。

1.8 評價EPCs衰老的情況 采用SA-β半乳糖苷酶染色法判斷EPCs衰老的情況，將共培養(yǎng)24 h后的EPCs接種于6孔板，吸除細胞培養(yǎng)液，用磷酸緩沖鹽溶液洗滌1次，加入1 mL半乳糖苷酶染色固定液，室溫固定15 min。吸除細胞固定液，用磷酸緩沖鹽溶液洗滌細胞3次，每次3 min。吸除磷酸緩沖鹽溶液，每孔加入1 mL染色工作液。恒定溫度37℃孵育過夜，用保鮮膜封住孔板防止蒸發(fā)。高倍鏡視野（×200）下計數(shù)10個典型視野的衰老細胞數(shù)。

1.9 采用錯配有限延伸法檢測端粒酶活性 參照文獻［4］，各組分別干預EPCs 72 h，用磷酸緩沖鹽溶液洗滌3次，收集細胞，去除磷酸緩沖鹽溶液，冷裂解緩沖液中加入終濃度為200 U／mL的RNA酶抑制劑，0.1 mmol／L 的苯甲脒和 1 mmol／L 的二硫蘇糖醇，加入200 μL上述含抑制劑的冰裂解緩沖液，懸浮細胞沉淀，漩渦震蕩10 s，冰浴30 min，其中間隔數(shù)分鐘，漩渦震蕩1次，共5次；4℃下12 000 r／min 離心 20 min（離心半徑為 8 cm），吸取約160 μL的上清液（端粒酶提取物），轉移至新的離心管中，每管分裝20 μL，進行下一步PCR實驗。端粒酶提取物加入1×TRAP緩沖液（20 mmol／L Tris-HCl，pH 8.3，1 mmol／L EDTA，0.05%Tween 20，63 mmol／L KCl，0.1 mg／L BSA，1.5 mmol／L MgCl2）、50 μmol／L脫氧腺苷三磷酸（dATP）和脫氧鳥苷三磷酸（dGTP）、1 μmol／L 端粒酶底物，在 30 ℃條件下反應30 min，然后在94℃下滅活5 min。再加入50 μmol／L 的脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP）、2 U TaqDNA 酶 ，1 μmol／L 長鏈引物，在 60 ℃條件下反應10 min。加入下游引物，第一階段94℃持續(xù)30 s，50℃持續(xù)60 s，72℃持續(xù)90 s，進行2個循環(huán)；第二階段94℃持續(xù)30 s，60 ℃持續(xù) 30 s，72 ℃持續(xù) 30 s，進行30個循環(huán)。然后加入250 μL封閉液37℃下封閉 30 min 后，100 μL 封閉液＋5 μL TRAP 反應產(chǎn)物在37℃下孵育1 h，加入100 μL終止液振蕩。在酶標儀上，以 690 nm作為參比波長（A690），測定樣品在450 nm波長的吸光度值（A450）。差值ΔA＝A450－A690，代表細胞端粒酶活性。

1.10 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計處理。計量資料符合正態(tài)分布以（x±s）表示，2組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析檢驗。

2 結 果

2.1 EPCs的形態(tài)變化 培養(yǎng)初期均為單個核細胞，培養(yǎng)至第5天出現(xiàn)梭形細胞，第10天出現(xiàn)呈集落樣貼壁生長的梭形細胞，之后細胞迅速擴增，至第14天細胞簇形成“鋪路石樣”，見圖1。

圖1 不同培養(yǎng)時間EPCs形態(tài)圖（×200）

2.2 EPCs鑒定 共聚焦顯微鏡下DiL-acLDL和FITC-UEA-1雙染色陽性，可鑒定培養(yǎng)所得的細胞為正在分化的EPCs，見圖2。

圖2 EPCs鑒定圖（×200）

2.3 4組EPCs增殖、黏附能力、衰老和端粒酶活性的比較 見表1。

3 討 論

在正常情況下血管內(nèi)皮損傷與EPCs修補之間存在動態(tài)平衡，維持內(nèi)膜完整性，而EPCs的數(shù)量減少、功能下降會導致內(nèi)皮損傷的修復不足，動脈管腔裸露，啟動和加速動脈粥樣硬化的進程。EPCs功能與衰老也密切相關，細胞衰老是細胞增殖與分化能力和生理功能逐漸發(fā)生衰退的變化過程［1］。丹參多酚酸鹽是丹參最重要的有效活性成分，具有抗動脈粥樣硬化、抗炎、抗腫瘤、抗氧化損傷等多種藥理作用［5］。研究發(fā)現(xiàn)丹參多酚酸鹽能夠修復糖基化終產(chǎn)物引起的EPCs功能障礙［6］。丹參及其提取物丹參多酚酸鹽可能通過改善EPCs功能達到促進血管新生的作用［7］。

表1 4組EPCs增殖、黏附能力、衰老和端粒酶活性的比較（x±s）

本研究顯示，丹參多酚酸鹽能促進EPCs的增殖，提高EPCs的黏附能力，且與藥物濃度相關，以5 mg／L濃度作用最強。隨著丹參多酚酸鹽濃度的增加，EPCs功能并沒有獲得更大的提高，反而有減弱傾向，與“少火生氣，壯火食氣”頗有異曲同工之妙，提示適量的丹參多酚酸鹽來活血化瘀可以改善EPCs的功能，從而促進血管內(nèi)皮損傷的修復和血管新生，是動脈粥樣硬化性疾病的一個治療思路。同時，丹參多酚酸鹽的劑量并非越大越好，適量可取得最佳效果。

有研究顯示，端粒結構被破壞后會促進內(nèi)皮細胞衰老，細胞黏附因子1表達升高，內(nèi)皮一氧化氮合酶活性下降，導致內(nèi)皮功能紊亂；相反，過表達TERT誘導端粒酶活性增加，使得內(nèi)皮細胞壽命延長并改善衰老導致的功能障礙［8］。與健康人相比，冠心病患者的冠狀動脈內(nèi)皮細胞的端?？s短更加明顯，且同一患者冠狀動脈斑塊處內(nèi)皮細胞的端粒比非斑塊處短，提示由端粒縮短引起的局部內(nèi)皮細胞衰老和功能障礙在冠狀動脈粥樣硬化中發(fā)揮重要作用［9］。而端粒長度依賴于端粒酶的調(diào)控。端粒酶缺陷的小鼠模型表現(xiàn)出干細胞耗竭、器官系統(tǒng)功能衰竭和組織再生修復能力下降等衰退表現(xiàn)，而內(nèi)源性端粒酶再激活可以顯著逆轉小鼠多種組織的退行性變化，且未增加癌癥的發(fā)生風險，提示端粒酶可以作為延緩衰老和治療衰老相關疾病的潛在靶點［10］。

本研究觀察丹參多酚酸鹽對EPCs衰老和端粒酶活性的影響，結果顯示：適量的丹參多酚酸鹽可以抑制EPCs衰老，但是對端粒酶活性并沒有明顯影響，提示丹參多酚酸鹽的抗細胞衰老作用途徑可能不是通過影響端粒酶活性實現(xiàn)的，結合細胞衰老的氧自由基學說、分子交聯(lián)學說等理論，考慮丹參多酚酸鹽的抗細胞衰老作用可能是通過其他途徑實現(xiàn)的，有待下一階段的研究進一步明確。從另一角度講，丹參多酚酸鹽對端粒酶活性無明顯影響，那么就不會有因其抗衰老作用而導致細胞永生化、增加癌癥發(fā)生風險的擔憂。綜上所述，適量的丹參多酚酸鹽可以增強EPCs功能，延緩EPCs細胞衰老，成為動脈粥樣硬化性疾病治療的一個安全有效選擇。