李續(xù)博，姜廣宇，董 航，趙 旭*

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學佳木斯學院，黑龍江 佳木斯 154007；2.佳木斯大學附屬第一醫(yī)院腦外科，黑龍江 佳木斯 154002；3.佳木斯大學附屬第一醫(yī)院血液科，黑龍江 佳木斯 154002）

急性髓系白血?。╝cute myeloidleukemia，AML）的發(fā)生與患者體內(nèi)造血干細胞的惡性克隆導(dǎo)致早期原始細胞大量增殖，分化凋亡障礙有關(guān)。目前，臨床上預(yù)防和治療髓外白血病的方法主要是加大化療劑量或聯(lián)合放療，作用機理是使化療藥物透過血腦屏障、血睪屏障直接殺傷腫瘤細胞，但其毒副作用突出，嚴重影響腫瘤患者的生存質(zhì)量。從白血病細胞浸潤轉(zhuǎn)移的機理方面考慮，尋找抑制其浸潤轉(zhuǎn)移的藥物是目前研究的熱點。已有研究報道，川芎嗪具有抑制腫瘤細胞生長、逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞多藥耐藥、化療增效與減毒、放射增敏與放射保護以及調(diào)節(jié)免疫等作用[1-4]。

我國傳統(tǒng)中藥川芎嗪具有多方面的抗腫瘤活性，這是眾多化療藥物所不能及的，新近研究表明川芎嗪可以抑制實體腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移，且已有研究結(jié)果已經(jīng)證明川芎嗪可以有效的抑制HL-60 細胞的粘附和侵襲能力[5-13]。因此，本實驗采用代謝組學技術(shù)靶向探究人THP-1 細胞的代謝機制，明確核心靶標。同時基于代謝水平評價川芎嗪的藥效，為揭示急性髓系白血病的發(fā)病機制和川芎嗪的作用機制提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 Q-Exactive 超高分辨質(zhì)譜儀（美國Thermo 公司）；XS104 /204/205DU 分析天平（美國梅特勒-托利多）；MPC-P25 微孔板迷你離心機（中國奧盛儀器有限公司）；MIX-2500 迷你混合儀（中國佑寧儀器有限公司）；測定儀臺式快速離心濃縮干燥器（中國亞歐德鵬科技有限公司）；25 cm2斜頸細胞培養(yǎng)瓶（中國信裕生物科技有限公司）；Biosafer-40TD 純水機（中國賽飛公司）。胎牛血清、McCoy's 5A 液體培養(yǎng)基、DMEM（中國聯(lián)碩生物科技有限公司）高糖培養(yǎng)液。THP-1 細胞（上海紀寧JN-B1139），川芎嗪（赫澎生物上?？萍加邢薰?0161025）。

1.2 細胞培養(yǎng) THP-1 細胞采用McCoy's 5A 培養(yǎng)液在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，待細胞融合率達70%～80%時傳代。將THP-1 細胞以每孔2×106接種于6 孔細胞培養(yǎng)板，將6 孔板細胞分為空白組（加入等體積的細胞培養(yǎng)液），川芎嗪組（加入含川芎嗪濃度2.5 μg/L 培養(yǎng)液1 mL），實驗組每組各重復(fù)6 個平行孔。

1.3 細胞提取方法 取對數(shù)期生長的細胞，棄去培養(yǎng)基，以生理鹽水清洗細胞3 遍，液氮淬滅后加入1.5 mL的甲醇-水（4：1，v/v）溶液，細胞刮刀取下細胞，并置入1.5 mL 離心管中渦旋，超聲破碎細胞。細胞破碎后離心（4℃、4 000 r/min、15 min）。取上清液氮氣吹干，100 μL 的0.1%甲酸復(fù)溶。

1.4 分析條件 色譜柱：ACQUITY UPLCTM HSS T3（100 mm×2.1 mm i.d.，1.8 μm）（Waters集團公司，美國）；流動相：A 為0.13%甲酸-水，B 為0.1%甲酸-乙腈；柱溫：40 ℃；流速：0.4 mL/min；進樣量：3 μL；梯度洗脫方法見表1。離子噴霧電壓：5.5KV；離子源溫度：600 ℃；解簇電壓（DP）：100V；碰撞能量（CE）：35 eV。氮氣為霧化氣和輔助氣：霧化氣55 psi，輔助氣55 psi，氣簾氣35 psi。m/z 在100 ～1200 amu 質(zhì)量范圍進行全掃描，積累時間250 ms。IDA 采用標準：每個分析物，超過100 cps 的8 個最強的碎片離子在100 ～1200 amu 質(zhì)量范圍內(nèi)進行子離子掃描，累積時間為100 ms。碰撞電壓差為15 eV，動態(tài)背景扣除DBS 開啟。自動校準系統(tǒng)（CDS）對MS 和MS/MS 自動進行調(diào)節(jié)和校正。

表1 大鼠尿液樣品UPLC 流動相梯度洗脫方法

1.5 數(shù)據(jù)處理及生物標記物鑒定 原始數(shù)據(jù)通過代謝組學權(quán)威在線分析系統(tǒng)XCMS-Online 進行數(shù)據(jù)預(yù)處理，之后將包含質(zhì)合比、強度、保留時間的數(shù)據(jù)包導(dǎo)入SIMCA 11.5 用于模式識別，結(jié)合偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）結(jié)果對分組貢獻率大的內(nèi)源性小分子代謝產(chǎn)物。最終通過Metline（http://metlin.scripps.edu）、HMDB（http://www.hmdb.ca）、KEGG（https://www.kegg.jp）等數(shù)據(jù)庫進行檢索和比對以鑒定生物標記物。

2 結(jié)果

2.1 代謝組學研究 通過降維處理得到影響代謝分布的主成分分析示意圖，由圖1可知，空白組、模型組和給藥組的組內(nèi)聚類良好，組間分離明顯?？瞻捉M和模型組組間分離明顯，證明2組細胞內(nèi)的代謝產(chǎn)物具有極大差異，可能由于人THP-1 細胞的異常代謝導(dǎo)致，經(jīng)川芎嗪治療后呈部分回調(diào)趨勢，處于空白組和模型組之間，通過代謝分布可知川芎嗪對人THP-1 細胞有很好的治療作用；經(jīng)OPLS-DA 篩選空白組和模型組組間對分組具有顯著性貢獻的小分子代謝產(chǎn)物作為潛在生物標記物，共鑒定6 個潛在生物標記物（表2），并根據(jù)構(gòu)建代謝通路圖（圖2）及代謝通路分析（表3）。

圖1 人THP-1 細胞主成分得分圖

圖2 人THP-1 細胞代謝通路圖

表2 人白血病THP-1 細胞生物標記物

表3 人白血病THP-1 細胞代謝通路分析

3 討論

苯丙氨酸是所有哺乳動物的必需氨基酸，其膳食攝入量對蛋白質(zhì)生物合成至關(guān)重要。苯丙氨酸可以通過羥基化代謝成酪氨酸。我們的結(jié)果顯示，人THP-1細胞的苯丙氨酸和酪氨酸的水平顯著高于空白組；苯丙氨酸的水平遠大于酪氨酸。這意味著在癌癥負荷下，來自宿主的蛋白質(zhì)的降解也得到增強，這是由顯著降低的血清白蛋白水平所支持的，以產(chǎn)生糖異生和分解代謝所需的氨基酸來供給TCA 循環(huán)。

谷氨酰胺不是一種必需氨基酸，但具有多種生理功能。它是體內(nèi)的氮載體，是快速增殖的細胞主要燃料來源，如淋巴細胞、單核細胞和腫瘤細胞等。谷氨酰胺可以轉(zhuǎn)化為葡萄糖作為能源，也可用于嘌呤和嘧啶的生物合成，作為DNA 和RNA 生物合成的構(gòu)建塊。在正常狀態(tài)下，細胞內(nèi)的谷氨酰胺保持在一個相當恒定的水平。在癌癥患者中，快速增殖的腫瘤細胞是谷氨酰胺的主要消耗者，并且隨著疾病的進展，宿主血液中谷氨酰胺逐漸耗盡。本次研究發(fā)現(xiàn)人THP-1 細胞內(nèi)谷氨酰胺含量下降與先前對其他類型癌癥的觀察結(jié)果一致。

膽堿在與細胞膜相關(guān)的磷脂代謝中起著重要的作用，并且在腫瘤細胞體外和體內(nèi)NMR 研究中發(fā)現(xiàn)磷酸膽堿的升高以及總膽堿含代謝物升高。這被認為是癌癥中膽堿磷脂代謝異常的一個特征。在這項研究中觀察到的胞內(nèi)膽堿的低水平可能是由于白血病細胞增殖過程中膽堿及其衍生物的過度需求所致。

本研究通過代謝組學技術(shù)全局分析人THP-1 細胞的代謝，通過模式分析獲得6 個生物標記物可能與急性髓系白血病的發(fā)病密切相關(guān)，可為臨床診斷及急性髓系白血病的機制研究提供實驗基礎(chǔ)。