高進(jìn)濤，何榮安，莫文飛

連冬麗，黃小芳，張婉青

(桂林醫(yī)學(xué)院生物技術(shù)學(xué)院，廣西 桂林 541100)

氧化應(yīng)激是指機(jī)體在內(nèi)外因素的刺激下，促氧化和抗氧化穩(wěn)態(tài)失衡，活性氧(reactive oxygen species,ROS)過(guò)量積累所引起的一系列應(yīng)激反應(yīng)[1]。過(guò)量ROS的產(chǎn)生可導(dǎo)致細(xì)胞損傷，與多種疾病的發(fā)生相關(guān)聯(lián)[2]。皮膚是人體重要的屏障，相較于其他器官，更容易受到內(nèi)外源刺激的影響，從而形成氧化應(yīng)激，其參與多種皮膚疾病的發(fā)生，如皮膚老化、炎癥性皮膚病、表皮腫瘤等[3]。

白藜蘆醇(resveratrol)是一類非黃酮類多酚化合物，廣泛存在于多種植物中，如葡萄、藜蘆、花生、虎杖等，是植物抵御外界刺激而產(chǎn)生的保護(hù)素[4]。研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤及保護(hù)心腦血管等多種生物效應(yīng)[5]。H2O2是ROS的一種重要成分，本研究采用H2O2處理人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞系HaCaT細(xì)胞，構(gòu)建表皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型，觀察白藜蘆醇是否能夠抑制H2O2誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，并初步探討其機(jī)制，以期為預(yù)防或治療氧化應(yīng)激性皮膚損傷提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

HaCaT細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院昆明細(xì)胞庫(kù)，胎牛血清、DMEM和胰酶均購(gòu)自Gibco公司。白藜蘆醇、H2O2和二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)均購(gòu)自Sigma公司。鋅原卟啉(Zinc protoporphyrin,ZnPP)購(gòu)自Alfa Aesar公司。CCK-8試劑購(gòu)自東仁化學(xué)科技有限公司。超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。Trizol和引物購(gòu)自Invitrogen公司。RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit購(gòu)自ThermoFisher公司。SYBR Green qPCR Master Mix購(gòu)自Bimake公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基中，并置于37℃、5% CO2的孵箱中常規(guī)培養(yǎng)、傳代。

1.3 細(xì)胞活力檢測(cè)

HaCaT細(xì)胞接種于96孔板，經(jīng)過(guò)不同處理后，每孔加入10μL CCK-8試劑，37℃避光孵育2h，用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm處的光密度，檢測(cè)細(xì)胞活力。

1.4 細(xì)胞SOD和GSH-Px活性測(cè)定

HaCaT細(xì)胞經(jīng)不同處理后，棄細(xì)胞上清，PBS洗滌3次，胰酶消化并收集細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞沉淀3次，加入200μL預(yù)冷的PBS冰上超聲破碎裂解細(xì)胞5min,3000r/min、4℃離心5min，取上清按照SOD和GSH-Px試劑盒說(shuō)明進(jìn)行活性測(cè)定。

1.5 總RNA的提取與qRT-PCR

采用Trizol法提取細(xì)胞內(nèi)總RNA，根據(jù)RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit說(shuō)明書，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄程序?yàn)椋?5℃5min，42℃60min，70℃5min。使用SYBR Green qPCR Master Mix進(jìn)行real time-PCR反應(yīng)，程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性10s；95℃ 5s；60℃ 10s；72℃ 10s；40個(gè)循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參，根據(jù)2-ΔΔCt值計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)引物序列：上游引物，5’-AGGGAATTCTCTTGGCTGGC-3’；下游引物為5’-GCTGCCACATTAGGGTGTCT-3’。GAPDH引物序列：上游引物為5’-CACATGGCCTCCAAGGAGTAA-3’；下游引物，5’-TGAGGGTCTCTCTCTTCCTCTTGT-3’。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 H2O2和白藜蘆醇對(duì)HaCaT細(xì)胞活力的影響

H2O2或白藜蘆醇處理HaCaT細(xì)胞24h后檢測(cè)細(xì)胞活力。結(jié)果顯示，低于400μmol/L的濃度處理均不表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性，細(xì)胞活力明顯降低主要出現(xiàn)在500μmol/L及以上(圖1)。因此本研究將采用不低于500μmol/L的H2O2處理HaCaT細(xì)胞構(gòu)建氧化應(yīng)激損傷模型。10μmol/L以下的白藜蘆醇處理對(duì)細(xì)胞活性的影響較小(圖1),因此本研究采用不高于10μmol/L的白藜蘆醇處理HaCaT細(xì)胞。

圖1 H2O2和白藜蘆醇對(duì)HaCaT細(xì)胞活力的影響(與0μmol/L比)

圖2 白藜蘆醇對(duì)H2O2處理的HaCaT細(xì)胞活力的影響

2.2 白藜蘆醇對(duì)H2O2處理的HaCaT細(xì)胞活力的影響

HaCaT細(xì)胞傳代至96孔板，采用不同濃度的白藜蘆醇(5、10μmol/L)預(yù)處理12h，之后加入500μmol/L或800μmol/L的H2O2處理12h，采用CCK-8測(cè)定細(xì)胞活力。與空白對(duì)照相比，500μmol/L或800μmol/L的H2O2處理皆能顯著降低細(xì)胞活力，而經(jīng)過(guò)白藜蘆醇預(yù)處理能夠減弱H2O2造成的HaCaT細(xì)胞活力降低(圖2)。

2.3 白藜蘆醇對(duì)H2O2處理的HaCaT細(xì)胞SOD和GSH-Px活性的影響

HaCaT細(xì)胞傳代至6孔板，采用10μmol/L的白藜蘆醇預(yù)處理12h，之后加入800μmol/L的H2O2處理12h，收集細(xì)胞測(cè)定SOD和GSH-Px活性。相較于空白對(duì)照，H2O2處理能夠顯著降低SOD和GSH-Px的活性，而白藜蘆醇預(yù)處理能夠部分恢復(fù)H2O2造成的HaCaT細(xì)胞SOD和GSH-Px活性下降(圖3)。

圖3 白藜蘆醇對(duì)H2O2處理的HaCaT細(xì)胞SOD和GSH-Px活性的影響

圖4 白藜蘆醇對(duì)HaCaT細(xì)胞HO-1 mRNA水平的影響

2.4 白藜蘆醇對(duì)HaCaT細(xì)胞HO-1表達(dá)的影響

HaCaT細(xì)胞傳代至6孔板，采用不同濃度白藜蘆醇(5、10、20、40μmol/L)處理24h，收集細(xì)胞，qRT-PCR方法測(cè)定HO-1的mRNA水平。結(jié)果顯示，白藜蘆醇處理能夠增加HO-1的表達(dá)，且呈現(xiàn)劑量依賴(圖4)。

2.5 ZnPP對(duì)白藜蘆醇細(xì)胞保護(hù)效果的影響

采用HO-1的抑制劑ZnPP處理HaCaT細(xì)胞24h后，CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力，結(jié)果顯示1μmol/L以下的ZnPP處理對(duì)細(xì)胞活性的影響較小(圖5(a))，因此后續(xù)研究中采用不高于1μmol/L的ZnPP處理HaCaT細(xì)胞。HaCaT細(xì)胞傳代至96孔板，采用白藜蘆醇(10μmol/L)或白藜蘆醇(10μmol/L)+ZnPP(0.5/1μmol/L)預(yù)處理12h，之后加入800μmol/L的H2O2處理12h，采用CCK-8測(cè)定細(xì)胞活力。與空白對(duì)照相比，H2O2處理能夠顯著降低細(xì)胞活力，而白藜蘆醇單獨(dú)預(yù)處理能夠減弱這一效應(yīng)，使細(xì)胞活力有所恢復(fù)(圖5(b))。相較于白藜蘆醇單獨(dú)預(yù)處理，HO-1的抑制劑ZnPP與白藜蘆醇混合處理能夠使細(xì)胞活力降低(圖5(b))。

(a) ZnPP對(duì)HaCaT細(xì)胞活力的影響 (b) ZnPP對(duì)白藜蘆醇細(xì)胞保護(hù)效果的影響圖5 ZnPP對(duì)白藜蘆醇細(xì)胞保護(hù)效果的影響

3 討論

白藜蘆醇自發(fā)現(xiàn)以來(lái)一直頗受醫(yī)學(xué)界重視，尤其是其抗氧化與自由基清除能力尤為突出[13,14]。本研究發(fā)現(xiàn)，500μmol/L以上的H2O2處理能夠顯著降低HaCaT細(xì)胞活力，而白藜蘆醇預(yù)處理能夠在一定程度上提高細(xì)胞活力，提示白藜蘆醇對(duì)體外培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞氧化損傷具有一定的保護(hù)作用。SOD和GSH-Px是細(xì)胞內(nèi)重要的抗氧化酶，是維持體內(nèi)氧化還原平衡重要的組成部分[15]。檢測(cè)SOD和GSH-Px活性能夠反映機(jī)體氧化還原平衡狀態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)，H2O2處理能夠顯著降低HaCaT細(xì)胞SOD和GSH-Px的活性，而白藜蘆醇預(yù)處理能夠部分恢復(fù)H2O2造成的HaCaT細(xì)胞SOD和GSH-Px活性下降。

HO-1亦稱熱休克蛋白32(heat shock protein,HSP32)，是機(jī)體內(nèi)重要的誘導(dǎo)性保護(hù)蛋白，能夠發(fā)揮抗氧化、抗炎、調(diào)控增殖和凋亡等眾多生物作用[16]。近年來(lái)，有研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇能夠誘導(dǎo)HO-1表達(dá)參與心肌細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的損傷保護(hù)[17～19]。本研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇同樣能夠誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞HO-1的表達(dá)，且呈現(xiàn)劑量依賴，提示白藜蘆醇對(duì)抗H2O2誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞損傷可能依賴于HO-1的表達(dá)。當(dāng)加入HO-1的抑制劑ZnPP，白藜蘆醇的細(xì)胞保護(hù)作用被大大削弱，提示白藜蘆醇對(duì)抗H2O2誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞損傷可能確與HO-1介導(dǎo)的細(xì)胞保護(hù)機(jī)制相關(guān)。

綜上所述，白藜蘆醇對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞氧化損傷具有保護(hù)作用，而這種保護(hù)作用可能是通過(guò)誘導(dǎo)HO-1的表達(dá)實(shí)現(xiàn)。本研究為白藜蘆醇預(yù)防或治療氧化應(yīng)激性皮膚損傷提供了試驗(yàn)依據(jù)。