曾凡濤 王新軍 楊卓 王修成 袁小威

鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院神經(jīng)外科（鄭州450052）

膠質(zhì)瘤是常見的神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，常導(dǎo)致癲癇 的發(fā)生［1］。膠質(zhì)瘤相關(guān)性癲癇患者不僅需要手術(shù)切除膠質(zhì)瘤，還需手術(shù)切除瘤周致癇灶以控制癲癇發(fā)作［2］。盡管手術(shù)治療在病灶及腫瘤致癇灶完全切除的情況下對(duì)癲癇有較好的控制，然而術(shù)后癲癇可能繼續(xù)存在，癲癇再發(fā)嚴(yán)重影響了患者的恢復(fù)和生存質(zhì)量［3］。與非膠質(zhì)瘤相關(guān)性癲癇相比較，膠質(zhì)瘤相關(guān)性癲癇對(duì)抗癲癇藥物的反應(yīng)性較差，預(yù)后不良［4］。已有研究表明，異檸檬酸脫氫酶1（isocitrate dehydrogenase 1，IDH1）基因突變類型中最常見的為R132H 型突變（編碼蛋白的氨基酸由精氨酸突變?yōu)榻M氨酸），此種類型突變占所有IDH1 突變類型的90%左右［5］。突變主要存在于Ⅱ、Ⅲ級(jí)及繼發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（Ⅳ級(jí)）中，且對(duì)患者的預(yù)后有重要影響［6］。研究［7-10］表明，在Ⅱ～Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤相關(guān)性癲癇患者中，突變與患者術(shù)前癲癇發(fā)作有密切關(guān)聯(lián)。但該突變與患者術(shù)后癇性再發(fā)的關(guān)系卻較少報(bào)道。為此，本研究通過免疫組化法檢測膠質(zhì)瘤相關(guān)性癲癇患者腫瘤組織中IDH1 R132H 突變情況，并探討該突變與患者術(shù)后癇性再發(fā)的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2012年3月至2017年3月于鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院手術(shù)治療的90 例膠質(zhì)瘤相關(guān)性癲癇患者。男49 例，女41 例，年齡21～68歲，平均（50.2 ± 17.5）歲。WHO 分級(jí)：Ⅱ級(jí)27 例，Ⅲ級(jí)18 例，Ⅳ級(jí)45 例。顳葉腫瘤35 例，非顳葉腫瘤55 例。入選標(biāo)準(zhǔn)：（1）術(shù)前CT/MRI 檢查提示顱內(nèi)占位、術(shù)后病理學(xué)檢查明確診斷為膠質(zhì)瘤；（2）根據(jù)臨床癥狀、腦電圖（EEG）、2010年國際抗癲癇聯(lián)盟（ILAE）標(biāo)準(zhǔn)確診為癲癇，術(shù)中皮層腦電圖定位顯示癲癇灶與腫瘤部位大致相同；（3）首次接受手術(shù)治療；（4）未接受任何放化療，但術(shù)后均服用1種或1 種以上一線抗癲癇藥物治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）精神心理異常者；（2）因顱內(nèi)感染、顱腦創(chuàng)傷、腦血管疾病及大腦發(fā)育異常等可能誘發(fā)癲癇發(fā)作的病史；（3）術(shù)后隨訪期內(nèi)因各種并發(fā)癥死亡的患者。

1.2 資料收集 對(duì)患者隨訪至術(shù)后1年，中途無失訪患者。根據(jù)患者術(shù)前病情、術(shù)后恢復(fù)情況，重新調(diào)整患者抗癇藥的使用并記錄其服藥數(shù)量。腫瘤累及部位、腫瘤切除范圍及術(shù)后腫瘤是否復(fù)發(fā)由CT/MRI 檢查獲得。對(duì)手術(shù)切除的標(biāo)本行常規(guī)石蠟包埋等處理。入選標(biāo)本及相關(guān)臨床信息均已獲患者家屬及醫(yī)院倫理委員會(huì)同意。

1.3 主要試劑與儀器 mIDH1 R132H 單克隆抗體型號(hào)1L-226（日本株式會(huì)社免疫生物研究所）；二抗反應(yīng)增強(qiáng)液型號(hào)PV-9000、二抗增強(qiáng)酶標(biāo)山羊抗小鼠/兔IgG 聚合物及DAB 顯色液型號(hào)ZLI-9019（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；熒光顯微鏡購自日本Nikon 公司。

1.4 IDH1 R132H 突變檢測及評(píng)判 將包埋標(biāo)本以3 μm 厚連續(xù)切片，置于防脫劑預(yù)處理后的載玻片上。滴加mIDH1 R132H 抗體（稀釋比為1∶100）于4 ℃冰箱孵育過夜；PBS 緩沖液清洗，后添加反應(yīng)增強(qiáng)液、增強(qiáng)酶標(biāo)山羊抗小鼠/兔IgG 復(fù)合物，DAB 顯色液鏡下顯色觀察；蘇木素復(fù)染、清水返藍(lán)后中性樹膠封片，鏡下觀察。以PBS 緩沖液代替一抗作對(duì)照。腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)有棕黃色或黃褐色顆粒為陽性。由兩名病理醫(yī)師采用雙盲法閱片和雙評(píng)分半定量法進(jìn)行評(píng)分，光鏡下隨機(jī)觀察8個(gè)高倍鏡視野，記錄4 個(gè)高倍視野（× 400）中染色陽性百分率，以陽性細(xì)胞超過10%為IDH1 R132H突變陽性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用生物統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件IBM SPSS 25.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理與分析。對(duì)數(shù)據(jù)行KS 正態(tài)性檢驗(yàn)，定量資料用表示，兩組間定量資料行t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料行卡方或Fisher 確切概率法檢驗(yàn)；采用Cox 回歸模型對(duì)術(shù)后癇性再發(fā)行多因素分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膠質(zhì)瘤相關(guān)性癲癇患者腫瘤組織IDH1 R132H 突變情況 對(duì)90 例患者的腫瘤組織行mIDH1 R132H 突變檢測，可見不同程度棕黃色或黃褐色的陽性信號(hào)表達(dá)（圖1），其中突變型32 例，野生型58 例，總體突變率為35.6%。突變型患者平均年齡為（37.1 ± 11.6）歲，野生型為（57.2 ±11.6）歲，兩者間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=11.547，P＜0.001）。突變主要發(fā)生在Ⅱ、Ⅲ級(jí)膠質(zhì)瘤中；腫瘤組織病理分型中突變以彌漫性星形細(xì)胞瘤和間變性星形細(xì)胞瘤居多；此外，該突變在膠質(zhì)瘤術(shù)后復(fù)發(fā)患者及術(shù)后服用較多數(shù)量抗癲癇藥患者中所占比例大，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

2.2 膠質(zhì)瘤相關(guān)性癲癇患者術(shù)后癲癇再發(fā)的相關(guān)因素分析 對(duì)所有患者隨訪至術(shù)后1年，對(duì)其行Engle 分級(jí)評(píng)分，以此作為術(shù)后癲癇有無再發(fā)的分組依據(jù)，將EngleⅠ級(jí)視為術(shù)后癲癇未發(fā)作，其余視為癲癇再發(fā)。其中，癇性再發(fā)38 例，癇性未發(fā)52 例，再發(fā)率42.2%（38/90）。未發(fā)組中突變率為15.4%，再發(fā)組中突變率為63.2%，兩者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=21.869，P＜0.001）。對(duì)術(shù)后癲癇再發(fā)行單因素分析，結(jié)果顯示腫瘤組織WHO 分級(jí)、腫瘤位于顳葉、腫瘤及致癇灶鏡下全切、腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)、患者術(shù)后服用抗癇藥數(shù)量以及IDH1 R132H突變與術(shù)后癇性再發(fā)有關(guān)（P＜0.05），見表2。將上述因素納入Cox 回歸模型中行多因素分析顯示：腫瘤位于顳葉、腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)以及IDH1 R132H 突變是患者術(shù)后癇性再發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，而腫瘤及致癇灶鏡下全切則為其獨(dú)立保護(hù)因素，見表3。

圖1 膠質(zhì)瘤組織中IDH1 R132H 型突變的表達(dá)（×400）Fig.1 Expression of IDH1 R132H type mutation in glioma tissues（×400）

表1 患者基本臨床特征及IDH1 R132H 突變情況Tab.1 Basic clinical characteristics of patients and IDH1 R132H mutation 例（%）

表2 影響患者術(shù)后1年內(nèi)癇性再發(fā)的單因素分析Tab.2 Univariate analysis of patients with epileptic recurrence within 1 year after surgery 例（%）

表3 影響患者術(shù)后1年內(nèi)癇性再發(fā)的Cox 多因素回歸分析Tab.3 Cox multivariate regression analysis of patients with epileptic recurrence within 1 year after surgery

3 討論

本研究顯示膠質(zhì)瘤相關(guān)性癲癇患者腫瘤組織中IDH1 R132H 突變率為35.6%，且突變型患者平均年齡較野生型小；突變主要發(fā)生在Ⅱ、Ⅲ級(jí)膠質(zhì)瘤中，分別為63.0%（17/27）和66.7%（12/18）；不同組織病理分型中突變也存有一定的差異性，以彌漫性星形細(xì)胞瘤和間變性星形細(xì)胞瘤居多。以上研究結(jié)果與先前國內(nèi)外研究報(bào)道基本相一致［8，11］。術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)患者突變概率較大，達(dá)57.1%（24/42）?？赡艿脑蚴荌DH1 R132H 突變型膠質(zhì)瘤血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）含量較高，而該突變破壞其本身親和力，與底物結(jié)合能力減弱的同時(shí)也與IDH1 野生型競爭底物，阻斷IDH1 活性，最終促使腫瘤復(fù)發(fā)和增殖［12］。此外，突變在患者術(shù)后服用抗癲癇藥數(shù)量間也存有明顯差異，服用抗癇藥數(shù)量≥3 種的患者腫瘤組織IDH1 R132H突變較高，這與國外研究［13］結(jié)論相一致。據(jù)此筆者推測突變促使腫瘤復(fù)發(fā)和增殖，而膠質(zhì)瘤的增殖可能形成癲癇病灶復(fù)合體［14］，引發(fā)腦組織異常放電，導(dǎo)致術(shù)后癲癇頻繁發(fā)作，從而需服用較多數(shù)量（≥3 種）的抗癇藥物對(duì)癲癇進(jìn)行控制。

已有研究表明［15］，大約有86%的患者癲癇再發(fā)于術(shù)后1年內(nèi)，且易形成難治性癲癇，因此本研究選擇對(duì)患者隨訪至術(shù)后1年。有研究［16-17］顯示腫瘤位于顳葉及腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)是影響患者術(shù)后癇性再發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，本組研究結(jié)論與其相一致。腫瘤及致癇灶鏡下全切則為其獨(dú)立保護(hù)因素，這也與已有的研究［2］結(jié)論相符合。本研究顯示IDH1 R132H 突變?yōu)榛颊咝g(shù)后癇性再發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。在目前少量已報(bào)道的文獻(xiàn)中，國內(nèi)有學(xué)者對(duì)低級(jí)別膠質(zhì)瘤患者中IDH1 突變與術(shù)后6 個(gè)月內(nèi)癇性再發(fā)的關(guān)系進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示IDH1突變對(duì)患者術(shù)后癇性再發(fā)無影響［18］，這與本研究結(jié)論相反。筆者推測膠質(zhì)瘤中IDH1 R132H 突變有可能是在患者手術(shù)半年后對(duì)癲癇再發(fā)產(chǎn)生了重要影響，也有可能僅僅是IDH1 R132H 型突變對(duì)患者術(shù)后癇性再發(fā)產(chǎn)生了影響，而其他類型突變則對(duì)其無影響，這都需要本研究組后期做進(jìn)一步的研究加以驗(yàn)證。國外也有學(xué)者對(duì)膠質(zhì)瘤IDH1 R132H 突變與術(shù)后癲癇再發(fā)頻率間的關(guān)系進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示術(shù)后1年內(nèi)該突變在癇性未發(fā)作患者及癇性發(fā)作頻率較高患者（平均＞1 次/月）間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，術(shù)后癇性發(fā)作頻率較高的腫瘤患者（平均＞1 次/月）IDH1 R132H 突變率較高，且該突變是其獨(dú)立危險(xiǎn)因素［13］，本研究所得結(jié)論與其有相似之處。到目前為止，有關(guān)膠質(zhì)瘤中IDH1 R132H 突變的潛在致癇機(jī)制現(xiàn)已有一定的研究，可能的原因是IDH1 突變細(xì)胞產(chǎn)生2-羥基戊二酸（D2-HG）［19］，D2-HG 在結(jié)構(gòu)上與谷氨酸相似且能激活N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受體［20］，從而導(dǎo)致了術(shù)后癲癇再發(fā)。此外，外源性D2-HG 將培養(yǎng)的大鼠神經(jīng)元放電率提高了4～6 倍，而D2-HG 的這種興奮作用能選擇性被NMDA 受體拮抗劑完全阻斷［8］，同時(shí)也揭示D2-HG 可能對(duì)瘤周組織具有重要致癇作用，這將為膠質(zhì)瘤相關(guān)性癲癇患者手術(shù)切除瘤周組織進(jìn)一步提供理論依據(jù)。

本組研究中經(jīng)Cox 多因素回歸分析顯示，患者術(shù)后服用抗癇藥的數(shù)量、不同腫瘤組織WHO 分級(jí)對(duì)患者術(shù)后1年內(nèi)癇性再發(fā)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，為其混雜因素，這與已有研究結(jié)論［13，21］分別相一致。表1中顯示膠質(zhì)瘤IDH1 R132H 突變與以上兩者有一定關(guān)聯(lián)，據(jù)此筆者推測患者術(shù)后服用抗癇藥的數(shù)量和不同腫瘤組織WHO 分級(jí)有可能是通過IDH1 R132H 突變間接對(duì)患者術(shù)后癇性再發(fā)產(chǎn)生了一定影響，但這需要后續(xù)更多的研究來證實(shí)。

綜上所述，本研究分析了膠質(zhì)瘤相關(guān)性癲癇患者腫瘤組織IDH1 R132H 突變及其對(duì)患者術(shù)后1年內(nèi)癇性再發(fā)的影響，對(duì)該突變的潛在致癇作用有了進(jìn)一步的了解。隨訪時(shí)間偏短及樣本量有限是本研究的不足之處，后續(xù)將繼續(xù)收集病例，延長隨訪時(shí)間，通過基因測序法進(jìn)一步論證IDH1 突變對(duì)患者術(shù)后不同時(shí)間段內(nèi)癲癇再發(fā)的影響。