高文捷 高冬梅 余小琴 徐元宏

1 安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院（合肥230022）；2合肥市第一人民醫(yī)院（合肥230061）

宮頸癌是全世界女性中最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，位居第四位，是導(dǎo)致女性死亡的重要疾病，世界衛(wèi)生組織（WHO）數(shù)據(jù)顯示［1］，2015年全球約有27.9 萬(wàn)女性死于宮頸癌。相關(guān)報(bào)道表明［2-3］，80%～85%的宮頸癌死亡發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家，而作為發(fā)展中國(guó)家之一，中國(guó)宮頸癌的發(fā)病率和病死率呈上升趨勢(shì)，2015年我國(guó)宮頸癌新發(fā)病例達(dá)9.89 萬(wàn)，死亡病例數(shù)達(dá)3.05 萬(wàn)。大量的流行病學(xué)和分子生物學(xué)研究表明，持續(xù)高危的人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染是宮頸癌及其癌前病變最主要的致病因素［4-5］。HPV 是一種無(wú)包膜病毒，由大約8 000 個(gè)堿基對(duì)組成的雙鏈環(huán)狀DNA 和正二十面體的蛋白質(zhì)衣殼組成。它可以感染人類的表皮和黏膜上皮細(xì)胞，引起各種良性和惡性腫瘤。目前已經(jīng)分離鑒定的HPV 亞型約有200 種，超過(guò)40 種與人類的泌尿生殖系統(tǒng)感染相關(guān)，其中許多型別與宮頸病變的發(fā)生密切相關(guān)。HPV 在全球范圍內(nèi)的感染具有普遍性，不同國(guó)家及地區(qū)的感染率及亞型分布不盡相同［6-7］。本文分析了合肥地區(qū)婦科患者HPV 亞型及其與宮頸病變的相關(guān)性，以了解本地區(qū)HPV 感染的現(xiàn)狀，為本地區(qū)宮頸癌前篩查和預(yù)防提供臨床及病理資料，進(jìn)而為HPV 感染所致宮頸病變的防治提供更加科學(xué)的理論依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 2017年1月至2018年7月在合肥市第一人民醫(yī)院婦科及相關(guān)科室就診的患者，年齡17 ～71 歲，平均39.5 歲。篩選及排除標(biāo)準(zhǔn)：患者就診時(shí)有不同程度的陰道分泌物增多、陰道不規(guī)則流血、宮頸慢性炎癥等癥狀，但排除宮頸錐切和子宮次全切除術(shù)等患者。該項(xiàng)研究對(duì)2 535例患者進(jìn)行了HPV-DNA 分型檢測(cè)，同時(shí)行宮頸病理組織活檢的患者共計(jì)230 例，并以病理結(jié)果作為診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。本研究符合人體試驗(yàn)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，并通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 標(biāo)本采集

1.2.1 樣本采集 HPV 檢測(cè)樣本由臨床醫(yī)生采集，所有患者采集前3 d 均無(wú)性交及陰道用藥史，非月經(jīng)期。宮頸刷插入患者的子宮頸旋轉(zhuǎn)3 ～5 周，然后將刷頭放入細(xì)胞保存液中送檢。

1.2.2 病理活檢 宮頸病理組織活檢標(biāo)本由陰道鏡醫(yī)師對(duì)可疑病變部位消毒后用活檢鉗咬取一定量標(biāo)本送病理檢查。對(duì)宮頸細(xì)胞學(xué)為高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變（HSIL），或圖像不充分，或懷疑有頸管病變，或病變向頸管內(nèi)延伸者，刮取宮頸管內(nèi)膜和黏液送病理檢查。若未觀察到異常，則常規(guī)取移行帶第3、6、9、12點(diǎn)4處送檢。

1.3 檢測(cè)方法與判斷標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1 HPV-DNA 分型檢測(cè) 采用PCR 反向點(diǎn)雜交技術(shù)，其原理是針對(duì)HPV 基因組晚期區(qū)LI 區(qū)設(shè)計(jì)特異引物和28 型探針，PCR 產(chǎn)物和條帶上的特異性探針雜交。通過(guò)雜交和洗膜，將靶標(biāo)中的特異性片段會(huì)和特異性探針結(jié)合，最后進(jìn)行顯色和結(jié)果分析，以檢測(cè)HPV 的基因型。本方法一次可檢測(cè)28 種型別的基因型，其中高危型15 種（16、18、31、33、35、39、41、51、52、56、58、59、68、73、82），疑似高危型3 種（26、53、66），低危型10 種。

1.3.2 檢測(cè)結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn) 兩個(gè)質(zhì)控點(diǎn)顯示陽(yáng)性，其他均為陰性則判讀為陰性；兩質(zhì)控點(diǎn)顯示陽(yáng)性，其余點(diǎn)≥1 個(gè)則判讀為陽(yáng)性，同時(shí)根據(jù)HPV 亞型分布圖判斷HPV 的型別。

1.4 病理活檢 送檢標(biāo)本經(jīng)常規(guī)的病理制片、HE染色、盲法閱片做出診斷。其結(jié)果可分為：（1）宮頸良性病變（炎癥或息肉）；（2）低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變（LSIL），主要包括輕度不典型增生（CIN1）和HPV 感染引起的細(xì)胞學(xué)改變；（3）HSIL，主要包括中度不典型增生（CIN2）和重度不典型增生（CIN3）；（4）鱗癌（SCC）。LSIL 及以上判定為病理組織學(xué)陽(yáng)性，并以此為金標(biāo)準(zhǔn)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，組間率的差異運(yùn)用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行比較，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HPV 感染類型和感染型別分布情況 納入研究的2 535 例患者中，篩查結(jié)果為陽(yáng)性的共734 例，HPV 感染率為29.0%，28 種型別均有檢出，檢出率位居前五位的基因型別依次為HPV16、HPV52、HPV58、HPV53 和HPV33。單一感染514 例，占感染總數(shù)的70.0%；多重感染者220 例，占感染總數(shù)的30.0%，最多者檢出7 種型別感染同時(shí)存在。高危HPV 感染率為22.4%，檢出率前五位的基因型別依次為HPV16、HPV52、HPV58、HPV33、HPV51；疑似高危型HPV 感染率為3.3%，檢出率最高的為53 型；低危型感染率為9.3%，檢出率居前五位的基因型別依次為HPV44、HPV42、HPV81、HPV61、HPV43。高危型的感染率明顯高于疑似高危型和低危型，三者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=37.75，P＜0.01）。分析發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是在單一感染還是多重感染患者中，HPV16、HPV58、HPV52 三種型別均排在前三位，見(jiàn)表1。

2.2 HPV 單型別感染和多重感染與宮頸病變的相關(guān)性 在2 535 例就診患者中，按照診療指南行陰道鏡下組織病理學(xué)活檢者共計(jì)230 例，其中HPV 檢測(cè)陽(yáng)性患者149 例，占64.8%；單型別感染者99 例，占43.0%；多重感染者50 例，占21.8%。依據(jù)組織病理結(jié)果將其分為兩組：即良性病變/LSIL 組，共計(jì)141 例；HSIL/SCC 組，共計(jì)89 例。宮頸良性病變/LSIL 組中HPV 的陽(yáng)性率為50.4%（71/141），宮頸HSIL/SCC 組HPV 陽(yáng)性率為87.6%（78/89），兩組感染率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=33.247，P=0.000）。宮頸良性病變/LSIL 組的單型別HPV 感染率為29.1%（41/141），HSIL/SCC 組的單型別感染率為65.2%（58/89），兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=28.988，P=0.000）。在宮頸良性病變/LSIL 組中多重HPV 感染比率為21.3%（30/141），HSIL/SCC 組中多重HPV 感染比率為22.4%（20/89），兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.046，P=0.831）。兩組間HPV 感染分布情況見(jiàn)表2。

表1 HPV 感染率和感染型別分布Tab.1 Distribution of HPV subtypes and infection rate

表2 HPV 單型別感染和多重感染與宮頸病變的關(guān)系Tab.2 Relationship between HPV infection mode and cervical lesions 例（%）

2.3 HPV 亞型在不同宮頸病變中的分布情況在行組織病理學(xué)檢查的231 例HPV（+）患者中共檢測(cè)出24 種亞型，檢出率居前五位者依次為HPV16、HPV58、HPV52、HPV33、HPV18，且均為高危型，其在宮頸病變組織的亞型分布情況見(jiàn)表3。HPV16型在LSIL、HSIL及SCC患者中占的比例依次為13.6%、28.7%、83.3%，可以推斷，隨著宮頸病變程度的加重HPV16 型所占比例隨之增高。HSIL/SCC患者分組中，HPV16型占37.5%（42/112）、HPV58 型占11.6%（13/112）、HPV52 型占8.9%（10/112）。分析不同宮頸病變中HPV 亞型的分布情況，HPV16 型與HPV58 型、HPV52 型比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=3.257、6.917，P＜0.05）；HPV52型和HPV58 型之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.529，P=0.467）。

表3 HPV 亞型在不同宮頸病變中的分布Tab.3 Distribution of HPV subtypes in different cervicallesions 例（%）

3 討論

WHO 關(guān)于宮頸癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)中明確提出必須有HPV 的感染，宮頸癌患者幾乎均能檢測(cè)到HPV感染的存在［8-9］。約90%的女性在性生活開(kāi)始后會(huì)發(fā)生至少一次HPV病毒的感染，但絕大多數(shù)患者均為無(wú)癥狀的一過(guò)性感染，超過(guò)80%的HPV感染病毒可在6 ～24個(gè)月內(nèi)被機(jī)體清除掉。2012年美國(guó)宮頸癌篩查指南提出，HPV檢測(cè)可用于未明確意義的不典型鱗狀上皮細(xì)胞的分流診斷。建議30 ～65 歲的女性每5年選擇一次細(xì)胞學(xué)和HPV 聯(lián)合檢測(cè)，HPV基因分型在宮頸癌篩查中的臨床價(jià)值得到了充分肯定。研究證實(shí)，同一型別的HPV持續(xù)感染與宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌的發(fā)病率密切相關(guān)。

據(jù)文獻(xiàn)［10］報(bào)道，HPV 在亞洲的感染率介于1.6% ～14.2%之間，我國(guó)普通婦女的感染率為15.71%。本研究顯示合肥地區(qū)篩查人群中HPV 的感染率為29.0%，感染率明顯高于上述研究。分析其原因可能有以下兩點(diǎn)：（1）岑堯等［10］做該項(xiàng)研究時(shí)間較早，近兩年隨著人們經(jīng)濟(jì)生活水平的提高，人們對(duì)宮頸癌篩查預(yù)防認(rèn)識(shí)的不斷加深，接受HPV 檢測(cè)篩查的人數(shù)明顯增加；（2）該研究的主要對(duì)象來(lái)自門診就診患者，其中大部分患者具有相應(yīng)的臨床癥狀。本地區(qū)感染率高于深圳（2014-2016年：11.02%）、武漢（2014-2015年：17.68%），低于成都（2009-2014年：31.50%）、北京（2010-2012年：36.98%）、上海（2011-2015年：31.84%）等地區(qū)的報(bào)道［7，11］。究其原因，首先可能是監(jiān)測(cè)的時(shí)間段不一致；其次與研究的樣本量（深圳：10 624 例；北京31 091 例）、使用試劑及檢測(cè)方法不同有關(guān)。有報(bào)道顯示［2，7］，高危型別在西方國(guó)家主要以HPV16、HPV18 型最常見(jiàn)，我國(guó)以HPV16、HPV58、HPV52、HPV18 和HPV39 型最為常見(jiàn)，本研究HPV亞型檢出率居前五位者依次為HPV16、HPV52、HPV58、HPV53 和HPV33 型，與上述的文獻(xiàn)報(bào)道并不完全一致。合肥地區(qū)最常見(jiàn)的HPV 基因亞型與成都、北京、遼寧、天津、浙江等城市報(bào)道相吻合，以HPV16 型最為常見(jiàn)，而深圳、上海、廣州、武漢等城市以HPV52 型最為常見(jiàn)［7，11］。HPV 感染型別差異的原因可能與地域相關(guān)，我國(guó)幅員遼闊，不同地區(qū)的人群由于生活方式、氣候環(huán)境及種族基因易感性的不同，會(huì)導(dǎo)致同一個(gè)國(guó)家不同地區(qū)的HPV流行型別稍有差異。值得注意的是，此次研究發(fā)現(xiàn)，該地區(qū)疑似高危HPV53 型的感染率高于其他幾種高危型別，位居第四位，且在宮頸病變的人群中，其感染率位居第六位，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他幾種高危型別。因此HPV53 型是否對(duì)宮頸病變的發(fā)展以及組織分化發(fā)揮作用有待進(jìn)一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌患者中均存在較高比例的HPV 感染。宮頸HSIL/SCC組與良性病變/LSIL 組相比，前者的感染率明顯高于后者，且在單型別感染模式上前者的感染率亦顯著高于后者。以上研究結(jié)果印證了HPV 感染與宮頸癌前病變和宮頸癌密切相關(guān)，但在多重感染模式上二者比較差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究結(jié)果同時(shí)揭示，導(dǎo)致宮頸病變的關(guān)鍵因素是感染HPV 的型別而不是病毒型別種類的多少，即并不是感染的型別越多宮頸發(fā)生病變的可能性越大。據(jù)報(bào)道［12］，高危型HPV 單一感染可以使宮頸鱗癌的患病風(fēng)險(xiǎn)增加19.9 倍，而多重感染使該風(fēng)險(xiǎn)增加至31.8 倍；當(dāng)HPV16 與其他型別混合感染時(shí)，可大大增加宮頸病變的風(fēng)險(xiǎn)。本研究結(jié)果與上述觀點(diǎn)不一致，可能是因?yàn)檠芯恐形磳⒌臀Ｐ秃透呶Ｐ头珠_(kāi)考慮的原因，也不排除是因?yàn)闃?biāo)本量不足而不能體現(xiàn)其中的差別。

通過(guò)對(duì)不同宮頸病變中感染HPV 亞型的分析得出，HPV16 型在各級(jí)別宮頸病變類型中幾乎均位居第一位，隨著病變程度的加重其感染率也隨之升高。在HSIL/SCC組中，HPV16型所占比例明顯高于HPV58 型和HPV52 型，由此推測(cè)HPV16 型在宮頸高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌的發(fā)病中起著至關(guān)重要的作用，這與相關(guān)研究結(jié)論是一致的［5，13］。本研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是在普通篩查人群中還是在HSIL/SCC 病變?nèi)巳褐?，除了HPV16 型之外，該地區(qū)HPV 感染的其他主要型別為HPV58 和HPV52，該結(jié)論在中國(guó)女性HPV 感染型別分布的相關(guān)匯總分析中均被證實(shí)［14］。本研究尚存在一些不足：首先該研究局限于單個(gè)中心；其次存在樣本量相對(duì)不足的情況。下一步將利用新技術(shù)新方法開(kāi)展HPV 在宮頸病變中的應(yīng)用研究，注重多中心的合作，加大樣本量，從而使研究結(jié)論更具有代表性。

綜上所述，發(fā)生宮頸病變的關(guān)鍵因素是感染的HPV 型別而不是感染的HPV 亞型的數(shù)目。合肥地區(qū)普通人群常見(jiàn)的HPV 感染型別依次為HPV16、HPV52、HPV58、HPV53 和HPV33 型，在發(fā)生宮頸病變的人群中HPV 感染型別位居前三位的依次是HPV16、HPV58 和HPV52 型，無(wú)論普通人群還是宮頸病變患者中HPV16、HPV58 和HPV52 三種型別均占很大比例。目前，宮頸癌最理想且最有效的預(yù)防措施是注射HPV 疫苗［15］，近年來(lái)國(guó)內(nèi)上市的二價(jià)疫苗（針對(duì)HPV16、18 型）和四價(jià)疫苗（針對(duì)HPV16、18、6、11 型）都不包括HPV52 和HPV58 型，因此，這兩種疫苗的使用不能涵蓋該地區(qū)常見(jiàn)的HPV 感染類型。近期我國(guó)批準(zhǔn)的九價(jià)HPV 疫苗（針對(duì)HPV6、11、16、18、31、33、45、52、58型）覆蓋了本地區(qū)常見(jiàn)的HPV 感染型別。通過(guò)研究分析本地區(qū)HPV 流行的主要型別，有助于研制個(gè)體化的HPV 預(yù)防疫苗，進(jìn)而提高免疫效果，最終實(shí)現(xiàn)降低宮頸癌發(fā)病率的目標(biāo)。期望相關(guān)結(jié)論能夠?qū)戏实貐^(qū)的宮頸癌防治和疫苗制備提供一定的臨床參考價(jià)值。