程樹林 李雨根 陳雙全 黃靜 朱平宇 龔志勇

川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院泌尿外科（四川南充637000）

膀胱癌是泌尿生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之 一，發(fā)病率呈逐年上升態(tài)勢［1］。近年來，針對膀胱癌發(fā)生發(fā)展的機制研究不斷為臨床治療提供新的思路。長鏈非編碼RNA（lncRNA）是一類長度超過200 個核苷酸的轉(zhuǎn)錄本，隨著lncRNA 研究領域的不斷深入，越來越多的lncRNAs 被發(fā)現(xiàn)在腫瘤中異常表達，lncRNA 可能成為一種新型的基因治療工具或腫瘤診斷預后標志物［2-3］。LINC00158 是一種新發(fā)現(xiàn)的lncRNA，其在腫瘤尤其是膀胱癌中的作用機制研究未見報道。本研究旨在檢測LINC00158 在膀胱癌組織和細胞中的表達，并通過構(gòu)建轉(zhuǎn)染LINC00158至膀胱癌細胞，觀察LINC00158對膀胱癌細胞增殖和遷移的影響，探究LINC00158可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 14 例膀胱癌組織標本來源于2016年11月至2018年2月川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院泌尿外科手術(shù)切除標本，置于液氮中保存，標本均經(jīng)病理學確診?；颊呔炇鸨驹簜惱砦瘑T會批準的知情同意書。14 例膀胱癌患者術(shù)前均未接受過放化療。RPMI-1640 培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）和DMEM 培養(yǎng)基購自美國Gibco 公司。膀胱癌細胞株（T24、BIU-87、UMUC-3、J82）和正常膀胱上皮細胞（SV-HUC-1）購自武漢典型培養(yǎng)物保藏中心，T24、BIU-87 和J82 細胞使用含10% FBS 的RPMI-1640 培 養(yǎng) 基 培 養(yǎng)，UMUC-3 和SV-HUC-1 使 用 含10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光實時定量聚合酶鏈反應（qPCR）試劑盒購自美國Fermentas 公司；含有LINC00158 全長的質(zhì)粒和對照質(zhì)粒購自上海捷瑞生物科技有限公司。轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000 Reagent 購自美國Invitrogen 公司；Cell Counting Kit-8（CCK-8）試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司；一抗β-微管蛋白（β-Tubulin）、脾酪氨酸激酶（spleen associated tyrosine kinase，SYK）、細胞周期蛋白A2（CyclinA2）、細胞周期蛋白依賴性激酶2（CDK2）、β-連環(huán)蛋白（β-catenin）和神經(jīng)型鈣黏蛋白（N-cadherin）購自美國BD 公司；辣根過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗兔二抗購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 檢測方法

1.2.1 細胞轉(zhuǎn)染 在轉(zhuǎn)染前1 天，將生長狀態(tài)良好的T24 細胞接種于6 孔板。將T24 細胞分為對照組（轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒）和實驗組（轉(zhuǎn)染含有LINC00158全長的質(zhì)粒），根據(jù)LipofectamineTM2000 Reagent 說明書準備脂質(zhì)體和質(zhì)粒的稀釋液，混勻靜置15 min后加入6 孔板。轉(zhuǎn)染8 h 后更換為含10%FBS 的RPMI-1640 培養(yǎng)基。

1.2.2 qPCR 檢測LINC00158 和SYK mRNA 的表達 采用Trizol 法提取組織或細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以GAPDH 為內(nèi)參，依據(jù)qPCR 試劑盒操作說明，分別檢測LINC00158 和SYK mRNA 的表達。采用特異性引物序列如下：GAPDH：上游：CTGGGCTACACTGAGCACC，下游：AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG；LINC00158：上游：CCACGATAAAAGGGAACCCTGA，下游：GCGACGACCGCTTTCTTAAA；SYK：上游：CATGGAAAAATCTCTCGGGAAGA，下游：GTCGATGCGATAGTGCAGCA。

1.2.3 Western Blot 檢測蛋白表達 細胞裂解液裂解提取細胞總蛋白，調(diào)整蛋白濃度，取50 μg 總蛋白上樣后進行SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，相應一抗4℃孵育過夜，洗膜后相應二抗孵育2 h，洗膜后化學發(fā)光法曝光顯影。

1.2.4 CCK-8 法檢測細胞增殖 取對數(shù)生長期的兩組細胞以每孔2 × 103個接種于96 孔板，每組設置4 個復孔，每組5 個96 孔板，分別記錄1、2、3、4、5 d 細胞吸光度。在每個時間點，吸出培養(yǎng)基后加入配置好的CCK-8 溶液，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，取出后酶標儀檢測在490 nm 處96 孔板每孔的吸光度（OD）值。以時間為橫坐標，以吸光度為縱坐標，繪制細胞生長曲線。

1.2.5 細胞劃痕實驗 將兩組細胞消化接種到新的6 孔板，次日細胞長滿后，采用10 μL 移液器槍頭在6 孔板底部進行劃痕，采用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3 次，去除脫落細胞，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，采用倒置顯微鏡觀察劃痕愈合情況并拍照。劃痕愈合率=（0 h 劃痕寬度-24 h 劃痕寬度）/0 h 劃痕寬度×100%。

1.3 統(tǒng)計學方法 以上實驗所獲得的數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0 軟件進行統(tǒng)計分析。計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，實驗至少重復4 次，組間采用獨立樣本t檢驗比較差異。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 膀胱癌組織和癌旁組織中LINC00158 的表達 見圖1。LINC00158 在膀胱癌組織和癌旁組織中的相對表達分別為（0.90 ± 0.07）和（4.20 ±0.29），LINC00158 在膀胱癌組織中的相對表達低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

2.2 膀胱癌細胞株中LINC00158的表達 見圖2。 LINC00158在膀胱癌細胞株（T24、BIU-87、UMUC-3、J82）和正常膀胱上皮細胞（SV-HUC-1）中的相對表達分別為（0.23±0.03）、（0.75±0.04）、（0.36±0.03）、（0.61 ± 0.03）和（1.01 ± 0.08），LINC00158 在膀胱癌細胞株中的相對表達低于正常膀胱上皮細胞，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），在T24 細胞中的相對表達最低（P＜0.01）。

圖1 qPCR檢測LINC00158在膀胱癌組織和癌旁組織中的表達Fig.1 qPCR was used to detect the expression of LINC00158 in bladder cancer tissues and adjacent tissues

圖2 qPCR 檢測LINC00158 在膀胱細胞株中的表達Fig.2 qPCR was used to detect the expression of LINC00158 in bladder cell lines

2.3 兩組T24 細胞中LINC00158 和SYK mRNA的表達 見圖3。對照組和實驗組T24 細胞中LINC00158 的相對表達分別為（1.05 ± 0.18）和（5.71± 0.49），兩組比較有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），實驗組中LINC00158 的相對表達明顯增加。對照組和實驗組T24 細胞中SYK mRNA 的相對表達分別為（1.02 ± 0.12）和（3.21 ± 0.28），兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），實驗組中SYK mRNA 的相對表達明顯增加。

圖3 qPCR 檢測LINC00158 和SYK mRNA 在兩組膀胱細胞株T24 中的表達。Fig.3 qPCR was used to detect the expression of LINC00158 and SYK mRNA in two groups of bladder cell lines T24

2.4 SYK 和細胞增殖遷移相關蛋白表達變化 見圖4。膀胱癌細胞轉(zhuǎn)染LINC00158 后，SYK 蛋白表達明顯升高，與細胞增殖密切相關的蛋白CyclinA2和CDK2 表達明顯降低，上皮表型β-catenin 表達顯著升高，間質(zhì)表型N-cadherin 表達明顯降低。

2.5 LINC00158 對膀胱癌T24 細胞增殖的影響見圖5。CCK-8 法檢測兩組T24 細胞的增殖能力，酶標儀檢測并繪制生長曲線。結(jié)果顯示與對照組相比，實驗組T24 細胞由第3 天開始，細胞生長速度明顯減慢，提示LINC00158 可以抑制T24 細胞的增殖能力，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖4 Western Blot 檢測兩組細胞中SYK 蛋白的表達Fig.4 Western Blot was used to detect the expression of SYK protein in the two groups of cells

圖5 CCK-8 法檢測兩組T24 細胞的增殖能力。Fig.5 The proliferation ability of the two groups of T24 cells was detected by CCK-8 method

2.6 LINC00158 對膀胱癌T24 細胞遷移能力的影響 見圖6。劃痕實驗檢測兩組T24 細胞的遷移能力，對照組和實驗組T24 細胞在24 h 的劃痕愈合率分別為（69.82±5.42）%和（40.23±5.73）%，實驗組T24 細胞遷移速度明顯低于對照組（P＜0.05）。提示LINC00158 可抑制T24 細胞的遷移能力。

圖6 劃痕實驗檢測兩組T24 細胞的遷移能力（100×）Fig.6 Scratch test was used to detect the migration ability of two groups of T24 cells

3 討論

LncRNA 是近年來非編碼RNA 研究領域的熱點，自發(fā)現(xiàn)起就引起了極大的關注，由于lncRNA 缺乏有效的開放閱讀框或者包含多個終止密碼子，lncRNA并不能編碼蛋白［4］。lncRNA主要通過轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達，影響細胞的增殖、分化、凋亡、衰老、轉(zhuǎn)移等各種生理活動［5］。隨著lncRNA 研究領域的不斷拓展，lncRNA 在腫瘤特別是膀胱癌中的作用引起研究者廣泛的關注，lncRNA對腫瘤細胞的生命活動具有顯著的調(diào)節(jié)作用［6］。目前，多條lncRNAs被發(fā)現(xiàn)與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展相關，包括CASC2、UCA1、GAS5、LOC572558等［7-10］。

本研究通過檢測膀胱癌組織和細胞中LINC00158 的相對表達，發(fā)現(xiàn)LINC00158 在膀胱癌組織和細胞中表達明顯降低，提示LINC00158 可能成為一種新型的膀胱癌診斷標志物。通過瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)，在膀胱癌細胞系T24 中轉(zhuǎn)入含有LINC00158 全長的質(zhì)粒，并檢測LINC00158 在轉(zhuǎn)染后的相對表達，表明轉(zhuǎn)染可明顯提高LINC00158的表達。脾酪氨酸激酶（spleen associated tyrosine kinase，SYK）是一種非受體型的酪氨酸激酶，在信號轉(zhuǎn)錄過程發(fā)揮重要調(diào)控作用［11］。SYK 具有抑癌基因的作用，在很多惡性腫瘤中表達降低，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關，SYK 高表達可顯著抑制腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移，SYK 為尋找腫瘤新的診斷標志物和分子治療靶點提供了重要方向［12-13］。本研究結(jié)果顯示，高表達LINC00158 后，T24 細胞中SYK蛋白表達顯著升高，與細胞增殖密切相關的蛋白CyclinA2 和CDK2 表達明顯降低，表明LINC00158可能抑制了T24 細胞的增殖能力。膀胱癌遷移最重要的調(diào)控機制之一是上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），是指在特殊情況下，上皮細胞向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化，主要特征為間質(zhì)表型如N-cadherin 的獲得和上皮表型如β-catenin 的喪失［14-18］。高表達LINC00158 后，上皮表型β-catenin 表達顯著升高，間質(zhì)表型N-cadherin 表達明顯降低，表明LINC00158 可以抑制T24細胞EMT 的發(fā)生，T24 細胞在體外的遷移能力可能降低。本研究進一步通過CCK-8 法和劃痕實驗檢測發(fā)現(xiàn)，高表達LINC00158后，T24細胞的增殖能力和遷移能力明顯降低，提示LINC00158 可以抑制T24 細胞的體外增殖能力和遷移能力。LINC00158調(diào)控SYK蛋白表達的具體機制有待進一步探究。

綜上所述，LINC00158 可以明顯抑制膀胱癌細胞增殖和遷移能力，LINC00158 可能是通過促進SYK 基因的表達，從而抑制膀胱癌細胞的惡性生物學行為。本研究為LINC00158 作為新型基因工具治療膀胱癌提供了理論依據(jù)。