鄭杰靈 袁亞維

南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院放療科（廣州510515）

膠質(zhì)瘤是成人最常見的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤，約占腦部惡性腫瘤的80%［1］，根據(jù)病理可分為低度惡性及高度惡性膠質(zhì)瘤。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)膠質(zhì)瘤的發(fā)病率排在第7 位，病死率排在第8 位［2］。其中，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma，GBM）在成人腦腫瘤中死亡率最高，5年生存期約5%［3］。膠質(zhì)瘤的預(yù)后不僅與組織學(xué)分型相關(guān)，還與腫瘤分子病理學(xué)特征密切相關(guān)。2016年WHO 更新了中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的分類標(biāo)準(zhǔn)，開始引入分子診斷標(biāo)準(zhǔn)［4］?？梢?，膠質(zhì)瘤中的分子學(xué)研究取得很大的進(jìn)展。放射治療是治療高級(jí)別膠質(zhì)瘤的常規(guī)手段，也是最有效的輔助治療手段，可改善患者的預(yù)后，但是存在放射抵抗的患者中往往治療效果不佳，腫瘤常出現(xiàn)快速進(jìn)展及惡性侵襲［5］。因此，深入研究膠質(zhì)瘤放療抗性的分子機(jī)制，篩選出新的治療或增敏靶點(diǎn)以達(dá)到增加膠質(zhì)瘤的放療敏感性，抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移，提高放療效果，在膠質(zhì)瘤治療研究中至關(guān)重要。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA（LncRNA）的長(zhǎng)度通常大于200 個(gè)核苷酸，不編碼蛋白，其表達(dá)具有組織特異性和腫瘤類型特異性［5-7］。越來(lái)越多的研究表明，LncRNA 在轉(zhuǎn)錄前、轉(zhuǎn)錄后水平參與不同腫瘤的發(fā)生發(fā)展，如肺癌［8］、胃癌［9］、肝癌［10］、乳腺癌［11］等。其中，LncRNA在膠質(zhì)瘤中發(fā)揮抑癌或促癌的功能，可作為治療靶點(diǎn)以及預(yù)測(cè)預(yù)后的分子標(biāo)志［12-14］，可見，篩選出與膠質(zhì)瘤放療抵抗相關(guān)的LncRNA 同樣是潛在的放療增敏靶點(diǎn)。但是與膠質(zhì)瘤放療抵抗或侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的LncRNA 的研究很少，在前期研究中，筆者進(jìn)行RNA 芯片分析［15］，篩選出在膠質(zhì)瘤放療抵抗株M059K 中高表達(dá)，在敏感株M059J中低表達(dá)的LncRNA TCONS_00008552，本文擬研究其在膠質(zhì)瘤的放療抵抗、侵襲轉(zhuǎn)移的功能，并進(jìn)行機(jī)制的探索，以期為膠質(zhì)瘤放療抵抗的分子機(jī)制研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株M059K、M059J購(gòu)與美國(guó)模式菌種收集中心（ATCC）。使用含10%胎牛血清（GIBCO，Australia）、0.5%丙酮酸鈉（GIBCO）和0.5%非必需氨基酸（GIBCO）的DMEM-F12培養(yǎng)基（Gibco）進(jìn)行培養(yǎng)，置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中。

1.2 細(xì)胞照射 選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的膠質(zhì)瘤細(xì)胞進(jìn)行照射，放射源為VARIAN 2300EX 直線加速器6MV X線，源皮距為100 cm，照射劑量率為5 Gy/min。

1.3 提取RNA 和逆轉(zhuǎn)錄 用Trizol 試劑盒（Invitrogen）按照步驟提取RNA，測(cè)濃度后用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScriptTM RT reagent Kit，TAKARA）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄并置于-20 ℃冰箱保存。

1.4 RT-PCR 使用PCR 試劑盒（SYBR?Premix Ex TaqTM kit，TAKARA）進(jìn)行RT-PCR（LightCycler 480 real-time PCR system，Roche，Stockholm，Sweden），得到各組循環(huán)閾值（thresholdcycle，Ct），并采用2-△△Ct法對(duì)進(jìn)行相對(duì)定量計(jì)算。

1.5 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 按1 × 105個(gè)/孔的細(xì)胞密度把細(xì)胞接種于6 孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)到50%～70%時(shí)，按lipofectamin3000（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）試劑操作說(shuō)明進(jìn)行轉(zhuǎn)染24 h 后換液并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.6 Western Blot 檢測(cè) 用RIPA、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑混合物裂解細(xì)胞刮取蛋白，離心并收集上清，按照BCA 試劑盒（康為世紀(jì)）測(cè)定蛋白濃度并配平，然后經(jīng)凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、脫脂奶粉封閉后，孵育E-cadherin、Vimentin、cleaved PARP、β-actin 的一抗以及相應(yīng)二抗，最后進(jìn)行曝光顯影。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用SPSS 19.0 軟件（IBM Corp，Armonk，NY）完成，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、多樣本方差分析等統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行驗(yàn)證。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LncRNA TCONS_00008552 在膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中的表達(dá) 膠質(zhì)瘤細(xì)胞株M059J（DNA-PKcs 突變型）和M059K（DNA-PKcs 野生型）是在同一膠質(zhì)瘤腫瘤標(biāo)本中分離出來(lái)的一對(duì)細(xì)胞株，M059K 存在輻射抵抗，M059J 對(duì)輻射相對(duì)敏感（約30 倍）。以這兩種細(xì)胞株作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ托行酒治?，篩選出差異表達(dá)的LncRNA 和mRNA［15］。其中，LncRNA TCONS_00008552在M059K 中高表達(dá)，在M059J 中低表達(dá)。并通過(guò)RT-PCR 檢測(cè)兩株細(xì)胞中TCONS_00008552 在非照射和照射后的表達(dá)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖1），非照射或照射后（6 Gy）6、12、24 h放療抵抗株M059K中TCONS_00008552的表達(dá)量明顯高于放療敏感株M059J（F=78.56，P＜0.000 1）。說(shuō)明照射后放療抵抗株M059K中TCONS_00008552的表達(dá)量無(wú)明顯下降，提示TCONS_00008552可能與膠質(zhì)瘤細(xì)胞放療敏感性有關(guān)，TCONS_00008552 可能增加膠質(zhì)瘤細(xì)胞放療抵抗。

圖1 TCONS_00008552 在照射前或照射后6、12、24 h 的表達(dá)水平（6 Gy）Fig.1 The expression of TCONS_00008552 in M059K and M059J cells

2.2 TCONS_00008552 增強(qiáng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力 在放療抵抗株M059K 使用siRNA下調(diào)TCONS_00008552，在放療敏感株MO59J 用TCONS_00008552 慢病毒過(guò)表達(dá)載體上調(diào)其表達(dá)。首先通過(guò)MIT 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的存活及增殖能力有無(wú)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖2），與對(duì)照組相比，下調(diào)TCONS_00008552 后，細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯減慢，48 h開始兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（siRNA1：F=47.368，P=0.002；siRNA2：F=28.780，P=0.006）；上調(diào)TCONS_00008552 后，細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯加快，72 h兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=21.571，P=0.010）。初步表明TCONS_00008552 可以增強(qiáng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖能力。劃痕實(shí)驗(yàn)顯示（圖3），劃痕24 h后，下調(diào)TCONS_00008552 的M059K 細(xì)胞（43.67±8.81）%劃痕愈合率較對(duì)照組（70.33 ± 9.18）%顯著降低（t=2.965，P=0.041 3），提示TCONS_00008552 可促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移能力。Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖4），與對(duì)照組相比（272.33 ± 23.61），下調(diào)TCONS_00008552 后，M059K 穿過(guò)基底膜的細(xì)胞數(shù)量明顯減少（108.33 ± 12.71，t=8.649，P=0.001 0）；與對(duì)照組相比（107.33 ± 12.28），上調(diào)TCONS_00008552 后，M059J 穿過(guò)基底膜的細(xì)胞數(shù)量明顯增加（244.67±23.68，t=7.267，P=0.001 9）。說(shuō)明TCONS_00008552可增加膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲能力。通過(guò)Western Blot 檢測(cè)上皮間質(zhì)化過(guò)程（EMT）相關(guān)標(biāo)志物E-鈣黏蛋白（上皮標(biāo)志蛋白）、Vimentin蛋白（間質(zhì)標(biāo)志蛋白）的表達(dá)水平。結(jié)果顯示（圖5），與對(duì)照組相比，在M059K干擾TCONS_00008552后。E-鈣黏蛋白的表達(dá)升高、Vimentin 蛋白的表達(dá)降低。該結(jié)果顯示TCONS_00008552促進(jìn)膠質(zhì)瘤的上皮間質(zhì)化過(guò)程，提示TCONS_00008552 可通過(guò)EMT通路促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲的能力。

圖2 MTT 檢測(cè)干擾或過(guò)表達(dá)TCONS_00008552 對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響Fig.2 TCONS_00008552 promotes the proliferation of glioma cells

圖3 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TCONS_00008552對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響Fig.3 Migration was measured by wound healing assay

圖4 侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TCONS_00008552 對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響Fig.4 Invasion was measured by Transwell assay

圖5 Western Blot 檢測(cè)EMT 標(biāo)志蛋白的變化Fig.5 TCONS_00008552 promotes the migration and invasion by EMT pathway

2.3 TCONS_00008552可減輕放療輻射誘導(dǎo)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（圖6），在M059K 細(xì)胞中用siRNA 干擾TCONS_00008552，照射后（6 Gy）M059K 細(xì)胞的克隆形成能力明顯減弱（F=81.35，P＜0.000 1）。在M059K中下調(diào)TCONS_00008552后予6 Gy照射，24 h后檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白cleaved PARP的表達(dá)量變化情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖7），下調(diào)TCONS_00008552后，可明顯減少cleaved PARP的表達(dá)。說(shuō)明TCONS_00008552 可減輕因輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)放療抵抗。

圖6 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)照射后TCONS_00008552 對(duì)細(xì)胞克隆形成能力的影響Fig.6 Clonogenesis ability was tested by plate clonality assays

圖7 Western Blot 檢測(cè)照射后TCONS_00008552 對(duì)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.7 TCONS_00008552 promotes the radio-resistance by reducing apoptosis

3 討論

膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的腫瘤，具有高發(fā)病率、術(shù)后高復(fù)發(fā)性、高致死率及治療效果不佳的特點(diǎn)［16］。腫瘤特征包括持續(xù)的增殖信號(hào)、生長(zhǎng)抑制信號(hào)的鈍化、細(xì)胞凋亡的逃避、潛在的無(wú)限復(fù)制性、持續(xù)的血管生長(zhǎng)、遷移和侵襲、能量代謝重編程以及免疫逃逸等［17］。而LncRNA 參與這些腫瘤惡性生物學(xué)行為的各個(gè)過(guò)程［18-19］，在多個(gè)層面上（轉(zhuǎn)錄前調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等）調(diào)控基因的表達(dá)水平，并調(diào)控相關(guān)的信號(hào)通路［20］。近年來(lái)，腦膠質(zhì)瘤分子標(biāo)志物與病理分級(jí)、臨床特征等方面的研究越來(lái)越多［21-22］，其中，LncRNA 參與膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的研究已成為目前研究膠質(zhì)瘤分子機(jī)制的熱點(diǎn)。這些研究表明LncRNA 在膠質(zhì)瘤中也發(fā)揮重要的功能，如Notch1 激活可誘導(dǎo)LncRNA TUG1的表達(dá)促進(jìn)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞自我更新和存活［14］，HOTAIR在GBM中高表達(dá)并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖［23］，WIF1 通過(guò)下調(diào)LncRNA MALAT1 抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移［24］。

雖然放療在膠質(zhì)瘤的治療中發(fā)揮極其重要的作用，但LncRNA 與膠質(zhì)瘤放療敏感性相關(guān)的研究甚少，本研究以人膠質(zhì)瘤放療抵抗細(xì)胞株M059K和放療敏感株M059J 為研究對(duì)象，篩選出新的與膠質(zhì)瘤放療抵抗相關(guān)的LncRNA TCONS_00008552。TCONS_00008552 在放療抵抗株M059K 中高表達(dá)，在放療敏感株M059J 中低表達(dá)。因此推測(cè)TCONS_00008552 可能與膠質(zhì)瘤的放療敏感性相關(guān)。功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明TCONS_00008552 具有促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用，Western Blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示TCONS_00008552 促進(jìn)膠質(zhì)瘤的EMT。EMT 參與腫瘤各個(gè)過(guò)程，如腫瘤發(fā)生、腫瘤生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移以及治療抵抗［25］。在膠質(zhì)瘤中，EMT促使腫瘤細(xì)胞獲得干細(xì)胞特性，并促進(jìn)侵襲、轉(zhuǎn)移，增加放化療抵抗［26］。說(shuō)明TCONS_00008552 可通過(guò)EMT 促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。平板克隆形成和Western Blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TCONS_00008552 可促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的放療抵抗，減少凋亡相關(guān)蛋白的形成，說(shuō)明TCONS_00008552 可減輕放療輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，為DNA 損傷修復(fù)提供充分條件，從而抵抗電離輻射的損傷。

綜上所述，膠質(zhì)瘤的惡性程度高，侵襲力強(qiáng)，目前仍無(wú)較好的治療方法［27］，雖然膠質(zhì)瘤的診療不斷發(fā)展，但治療效果沒有明顯改善，復(fù)發(fā)率、病死率沒有明顯降低。而治療抵抗，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是膠質(zhì)瘤療效受限的主要原因，膠質(zhì)瘤的治療抵抗和轉(zhuǎn)移機(jī)制研究可為膠質(zhì)瘤的診治提供基礎(chǔ)資料。本研究發(fā)現(xiàn)，在放射抵抗株M059K 高表達(dá)的TCONS_00008552 對(duì)其增殖和侵襲能力具有重要的促進(jìn)作用，并增加其放療抵抗，提示該LncRNA可成為膠質(zhì)瘤放療增敏的潛在靶點(diǎn)。但是TCONS_00008552 在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)、與預(yù)后的關(guān)系等仍是未知的，本課題組將進(jìn)一步研究TCONS_00008552 的下游通路，闡明其在膠質(zhì)瘤中促癌及調(diào)控放療敏感性的分子機(jī)制，并且開展體內(nèi)實(shí)驗(yàn)以及在膠質(zhì)瘤組織上進(jìn)行驗(yàn)證，為L(zhǎng)ncRNA 相關(guān)的膠質(zhì)瘤研究提供新的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。