王永芳 宋姍姍 張春芳 陳昊

徐州醫(yī)科大學(xué)附屬連云港市第一人民醫(yī)院（江蘇連云港222002）

肺癌在我國(guó)發(fā)病率呈持續(xù)上升趨勢(shì)，其病死率在全球范圍內(nèi)已躍居惡性腫瘤之首，其中非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占肺癌總數(shù)的75% ～80%，腺癌和鱗癌是其最常見的病理亞型，盡管近幾十年來(lái)NSCLC 的診斷和臨床治療取得了突破性進(jìn)展，但NSCLC 患者5年總生存率僅約為15%，復(fù)發(fā)率仍居高不下［1-2］。近年來(lái)，腫瘤干細(xì)胞理論的提出為肺癌研究開辟了新方向，針對(duì)腫瘤干細(xì)胞的治療策略有望成為治療肺癌的有效手段之一［3］。Sox2 和Nanog 是維持成人和胚胎干細(xì)胞自我更新及多向分化潛能必不可少的轉(zhuǎn)錄因子，共同位于細(xì)胞多能性調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的核心位置，調(diào)節(jié)多能相關(guān)基因的表達(dá)［4-5］。多項(xiàng)研究［6-10］顯示Sox2 和Nanog 在多種腫瘤組織中表達(dá)失調(diào)，其異常表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。但同時(shí)研究?jī)烧咴贜SCLC 中表達(dá)的相關(guān)性報(bào)道較少，本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化技術(shù)聯(lián)合檢測(cè)Sox2 和Nanog 蛋 白 在NSCLC 的表達(dá)情況，并 分析它們與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，探討兩者在NSCLC 發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到的作用，為尋求潛在治療靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2010年6月至2017年6月在連云港市第一人民醫(yī)院手術(shù)切除的120 例NSCLC標(biāo)本作為觀察組，年齡30～76 歲，中位年齡61 歲；男90 例，女30 例，經(jīng)兩位高年資病理醫(yī)師依據(jù)2015年WHO 肺癌分類及診斷標(biāo)準(zhǔn)復(fù)核切片（鱗癌和腺癌各60 例）。腫塊直徑1.5 ～11 cm，中位直徑3.5 cm；臨床TNM 分期：Ⅰ期44 例、Ⅱ期36 例、Ⅲ期32 例、Ⅳ期8 例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移46 例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移74 例。所有患者均為首次發(fā)病且術(shù)前未進(jìn)行化療、放療及免疫治療，同時(shí)選取其中30 例患者癌旁組織（距癌組織≤3 cm）及正常肺組織（距癌組織＞3 cm）作為對(duì)照組。本研究獲得連云港市第一人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，樣本提供者均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑 兔抗人Sox2 單克隆抗體（即用型）購(gòu)自廣州安必平生物科技有限公司，兔抗人Nanog 單克隆抗體（濃縮液）購(gòu)自Cell Signaling Technology 公司，以1∶400 倍稀釋?？乖迯?fù)液、過(guò)氧化物酶阻斷劑、二抗、DAB 顯色液、PBS 均購(gòu)自美國(guó)DAKO 公司。

1.3 免疫組化 標(biāo)本均用4%中性甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm 厚連續(xù)切片，HE 染色，光鏡下觀察。免疫組化采用EnVision 二步法，應(yīng)用儀器Roche BENCH MARK XT 免疫組化染色儀行免疫組化染色。操作流程嚴(yán)格參照試劑說(shuō)明書要求，同時(shí)用PBS 代替一抗做陰性對(duì)照，已知陽(yáng)性的NSCLC 組織作陽(yáng)性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定 采用經(jīng)典半定量積分法［11］：陽(yáng)性細(xì)胞所占比例和著色強(qiáng)度兩因素綜合評(píng)分方法。選取染色均勻的陽(yáng)性腫瘤區(qū)域，每張切片選取5 個(gè)高倍鏡（× 200）視野，分別計(jì)算其陽(yáng)性細(xì)胞所占比例和著色強(qiáng)度。（1）按陽(yáng)性細(xì)胞所占比例計(jì)分：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜6%計(jì)0 分，6%～25%計(jì)1 分，26%～50%計(jì)2 分，51%～75%計(jì)3 分，＞75%計(jì)4 分；（2）按著色強(qiáng)度計(jì)分：標(biāo)本無(wú)著色為0 分，淡黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分。將兩項(xiàng)得分結(jié)果相乘：0 分為（-），1～4 分為（+），5～7 分為（2+），8 分以上為（3+），—為陰性，+為弱陽(yáng)性，2+為中陽(yáng)性，3+為強(qiáng)陽(yáng)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 Excel 收集數(shù)據(jù)，運(yùn)用SPSS 16.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，表達(dá)強(qiáng)度比較采用多組獨(dú)立樣本秩和檢驗(yàn)，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，兩種蛋白之間的相關(guān)性采用2×2 配對(duì)資料的關(guān)聯(lián)性分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Sox2 和Nanog 在NSCLC、癌旁及正常肺組織中的表達(dá)情況 Sox2 在NSCLC 組織中細(xì)胞核著色，以棕黃色顆粒為主，陽(yáng)性表達(dá)率為59.2%（71/120）；在癌旁組織中陽(yáng)性表達(dá)率為13.3%（4/30），以淡黃色顆粒為主；在正常肺組織中陽(yáng)性表達(dá)率為6.7%（2/30）；NSCLC 組織中Sox2 表達(dá)顯著高于癌旁組織及正常肺組織（均P＜0.01）。見圖1、表1。

圖1 Sox2 在肺鱗癌和腺癌中表達(dá)（EnVision 法，×200）Fig.1 The expression of Sox2 in lung squamous cell carcinoma and lung adenocarcinoma

Nanog 在NSCLC 組織中細(xì)胞核著色，以棕黃色顆粒為主，同時(shí)伴有細(xì)胞漿著色，Nanog 陽(yáng)性表達(dá)率為48.3%（58/120）；在癌旁組織中陽(yáng)性表達(dá)率為6.7%（2/30），以淡黃色顆粒為主；在正常肺組織中未見陽(yáng)性表達(dá)，三者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。見圖2、表1。

表1 Sox2 和Nanog 在不同病變肺組織中的表達(dá)Tab.1 Nanog and Sox2 were expressed in different lung tissues of different lesions例（%）

圖2 Nanog 在肺鱗癌和腺癌中表達(dá)（EnVision 法，×200）Fig.2 The expression of Nanog in lung squamous cell carcinoma and lung adenocarcinoma

2.2 Sox2、Nanog 表達(dá)與NSCLC 的臨床病理特征關(guān)系 Sox2 在肺鱗癌中陽(yáng)性率為81.7%，在肺腺癌中陽(yáng)性率為36.7%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；Nanog 在肺鱗癌中陽(yáng)性率為58.3%，在肺腺癌中陽(yáng)性率為38.3%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表2）。NSCLC 中Sox2 的表達(dá)水平與腫瘤大小有關(guān)，隨著腫瘤體積增大，Sox2 蛋白表達(dá)上調(diào)（表2）；Nanog的表達(dá)水平與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期有關(guān)，其中Nanog 的表達(dá)水平與腫瘤大小呈正相關(guān)，臨床分期Ⅲ＋Ⅳ者高于Ⅰ＋Ⅱ者，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者高于無(wú)轉(zhuǎn)移者（P＜0.05），但兩者陽(yáng)性表達(dá)與年齡和性別均無(wú)相關(guān)性（表2）。

表2 Sox2 和Nanog 蛋白表達(dá)與NSCLC 臨床病理的關(guān)系Tab.2 The correlation between expression of Nanog and Sox2 and clinicopathological characteristics of NSCLC 例（%）

2.3 NSCLC組織中Sox2和Nanog表達(dá)的相關(guān)性在120 例NSCLC 組織中Sox2 與Nanog 均陽(yáng)性 者41例（34.2%），均陰性者32 例（26.7%），Sox2 陽(yáng)性而Nanog 陰性者30 例（25.0%），Nanog 陽(yáng)性而Sox2 陰性者17 例（14.1%）。2×2 配對(duì)資料的關(guān)聯(lián)性分析顯示，在NSCLC 中Sox2 與Nanog 表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.227，P＜0.05）。見表3。

3 討論

Sox2 基因是Sox 家族的重要成員之一，位于染色體3q26.3-q27 上，通過(guò)與靶基因的HMG 結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合，從而維持胚胎干細(xì)胞自我更新及分化潛能，且在重新程序化體細(xì)胞使之成為多能干細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。胚胎期間的Sox2 保持沉默，而在機(jī)體發(fā)育過(guò)程中，Sox2 被激活參與細(xì)胞分裂分化［12］。對(duì)肺臟的發(fā)育來(lái)說(shuō)，Sox2 是一種重要的基因，多項(xiàng)研究［7，13］均顯示Sox2 在肺、食道及頭頸鱗癌中過(guò)表達(dá)。

表3 NSCLC 組織中Sox2 和Nanog 表達(dá)的相關(guān)性分析Tab.3 Expression correlation between Nanog and Sox2 in lung NSCLC tissues 例

專家組通過(guò)對(duì)178 例肺鱗癌基因圖譜測(cè)序數(shù)據(jù)表明Sox2 是與肺癌相關(guān)的癌基因，在肺鱗癌的發(fā)生發(fā)展中具有極其重要的作用［14］。為進(jìn)一步探討Sox2 蛋白表達(dá)與NSCLC 之間關(guān)系，本研究對(duì)120 例手術(shù)切除標(biāo)本采用免疫組化檢測(cè)，結(jié)果顯示NSCLC、癌旁組織及正常肺組織中Sox2 陽(yáng)性表達(dá)率呈降低趨勢(shì)，在NSCLC 中的表達(dá)率顯著高于癌旁組織和正常肺組織（均P＜0.01），此外，Sox2 表達(dá)與病理類型密切相關(guān)，在鱗癌中的表達(dá)顯著高于腺癌（81.7%vs.36.7%，P＜0.01）。這些研究結(jié)果與其他學(xué)者結(jié)論一致，YING 等［11］發(fā)現(xiàn)Sox2 在NSCLC 組織中高表達(dá)，其表達(dá)率為35.4%，顯著高于癌旁組織，Sox2 陽(yáng)性表達(dá)率在肺鱗癌為50.0%，肺腺癌中為20.3%。癌癥基因組圖譜專家的研究揭示，Sox2 基因所在染色體3q26 區(qū)域在包括肺鱗癌在內(nèi)的多種鱗癌中普遍擴(kuò)增，提示Sox2 基因拷貝數(shù)增加可能參與肺鱗癌的惡性進(jìn)展［14］。SASAKI 等［15］對(duì)127 例手術(shù)切除的肺非小細(xì)胞癌標(biāo)本研究發(fā)現(xiàn)，Sox2 蛋白表達(dá)在鱗癌為85.4%，腺癌為45.5%，基因拷貝數(shù)增加在鱗癌中為15.4%，而在腺癌中則為3.8%，他們認(rèn)為Sox2 基因拷貝數(shù)增加是引起其在肺鱗癌過(guò)表達(dá)的常見原因之一，而肺腺癌中Sox2 過(guò)表達(dá)可能是由轉(zhuǎn)錄水平或轉(zhuǎn)錄后修飾等其他機(jī)制引起。BASS 等［13］對(duì)肺和食管鱗癌的研究也表明Sox2 可能與鱗癌鱗狀上皮分化有關(guān)，它可以誘導(dǎo)鱗癌相關(guān)因子p63 和角蛋白6A 的表達(dá)并促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示Sox2 陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤大小正相關(guān)，究其原因較為復(fù)雜，CHOU 等［16］的研究認(rèn)為Sox2 可誘導(dǎo)激活EGFR 和BCL2L1 信號(hào)傳導(dǎo)通路，形成Sox2-EGFR 反饋環(huán)進(jìn)而促進(jìn)肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖，這可能是其促進(jìn)腫瘤體積增大的原因之一。RUAN等［17］在膀胱癌中研究也發(fā)現(xiàn)Sox2表達(dá)與腫瘤大小、腫瘤數(shù)量和腫瘤分級(jí)有關(guān)。有研究［18］表明Sox2 在NSCLC 中的高表達(dá)可以促進(jìn)NSCLC 患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和較晚的臨床分期，可能在NSCLC的浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移過(guò)程中起重要作用，Sox2 高表達(dá)的腫瘤惡性程度更高，預(yù)示患者較差的預(yù)后，推測(cè)其可作為NSCLC 獨(dú)立的預(yù)后因素。本研究中Sox2 陽(yáng)性表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期未見相關(guān)性，可能與本研究收集病例中晚期腫瘤組織標(biāo)本較少有關(guān)，故仍需更大樣本量多層次的深入研究。

Nanog 是又一重要的干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子，和Sox2一起在早期胚胎發(fā)育過(guò)程中對(duì)維持人體胚胎干細(xì)胞多向分化潛能及決定細(xì)胞分化命運(yùn)有重要作用，兩者主要通過(guò)形成調(diào)控環(huán)路、激活其靶基因并與其他信號(hào)通路協(xié)同作用來(lái)維持干細(xì)胞全能性和自我更新能力。研究表明Nanog 在肺癌球細(xì)胞和乳癌CD44+細(xì)胞等腫瘤干細(xì)胞中表達(dá)升高，減少Nanog 的表達(dá)可以有效降低腫瘤干細(xì)胞比例［19］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Nanog 蛋白在NSCLC 中的陽(yáng)性表達(dá)率為48.3%，顯著高于癌旁組織（6.7%），而在正常肺組織中未見陽(yáng)性表達(dá)；本研究還發(fā)現(xiàn)Nanog 蛋白的表達(dá)與NSCLC 患者某些臨床病理特征存在相關(guān)性，Nanog 蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率與腫瘤體積正相關(guān)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組高于無(wú)轉(zhuǎn)移組，臨床TNM分期Ⅲ＋Ⅳ者組高于Ⅰ＋Ⅱ者，表明Nanog 可能參與了NSCLC 的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移等多個(gè)過(guò)程。在其他腫瘤組織中也有相似的發(fā)現(xiàn)，LIU 等［20］發(fā)現(xiàn)卵巢癌患者組織中Nanog 在基因和蛋白水平均過(guò)表達(dá)，與腫瘤低分化顯著相關(guān)，敲除Nanog 基因后可以抑制卵巢癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移。NAGATA等［21］對(duì)乳腺癌患者的研究也發(fā)現(xiàn)，與Nanog 表達(dá)較弱的患者相比，Nanog 強(qiáng)表達(dá)的患者的無(wú)病生存率和總生存率顯著降低，Nanog 的強(qiáng)表達(dá)是乳腺癌患者預(yù)后不良的指標(biāo)，Nanog 可刺激乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。CHANG 等［22］對(duì)112 個(gè)肺癌大樣本的多變量分析結(jié)果顯示，Nanog 的表達(dá)與年齡、吸煙狀況和分期等臨床參數(shù)無(wú)相關(guān)性，但Nanog 高表達(dá)的患者無(wú)進(jìn)展生存期和總生存期縮短。然而也有研究［23］發(fā)現(xiàn)Nanog 蛋白可能在肺癌的起始階段發(fā)揮著重要作用，其研究結(jié)果顯示Nanog 在肺癌中的表達(dá)在無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，而與腫瘤大小未見相關(guān)性，但其研究結(jié)果也同樣表明Nanog 在肺癌中的表達(dá)顯著高于良性病變和正常肺組織，說(shuō)明Nanog 參與了肺癌的發(fā)生發(fā)展。但不同學(xué)者的關(guān)于Nanog 與臨床病理參數(shù)關(guān)系的結(jié)論不盡相同，也進(jìn)一步表明Nanog 對(duì)肺癌的作用可能存在極其復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制，受到微環(huán)境和其他多種因子共同調(diào)控，需要更多樣本量、更深層次和更廣泛腫瘤類型的深入研究。MA 等［24］新近提出了一種基于反dsDNA 抗體修飾的Fe304 磁鐵礦納米粒子的多色檢測(cè)方法，可以更加靈敏同時(shí)有針對(duì)性的快速檢測(cè)癌癥干細(xì)胞中Sox2、Oct4 和Nanog，該方法可以產(chǎn)生定量結(jié)果，可分析轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的多態(tài)性，為系統(tǒng)深入研究Nanog 干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子提供了高效的研究平臺(tái)。此外，本研究還顯示Nanog 蛋白的表達(dá)與NSCLC的組織類型相關(guān)，Nanog 蛋白在肺鱗癌和腺癌中均有表達(dá)，但其在鱗癌中的陽(yáng)性表達(dá)率較肺腺癌明顯升高（P＜0.05）。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相關(guān)分析顯示，NSCLC 組織中Sox2 蛋白表達(dá)與Nanog 蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，提示Sox2 和Nanog 在NSCLC 的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮協(xié)同作用。

綜上所述，Sox2 和Nanog 在NSCLC 中的表達(dá)明顯高于癌旁組織，并且兩者呈正相關(guān)，說(shuō)明兩者共同參與了NSCLC 的發(fā)生和進(jìn)展過(guò)程。此外，Sox2 和Nanog 的表達(dá)水平腫瘤大小及病理類型有關(guān)，在肺鱗癌中表達(dá)均顯著高于肺腺癌，Nanog 表達(dá)水平與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期密切相關(guān)，兩者相互協(xié)同在NSCLC 增殖轉(zhuǎn)移及侵襲中發(fā)揮重要作用，有望作為評(píng)估NSCLC 進(jìn)展和生物學(xué)行為的重要指標(biāo)，靶向Sox2 和Nanog 可能是潛在、高效的治療NSCLC 方法。這些研究結(jié)果為臨床工作中NSCLC 診斷和評(píng)估進(jìn)展提供了新的思路，但具體機(jī)制和應(yīng)用價(jià)值還有待進(jìn)一步深入研究。