劉小娟， 孫 科

成都市第二人民醫(yī)院 1.消化科； 2.肝膽外科，四川 成都 610000

胃癌是全球范圍內(nèi)常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，在全球癌癥相關(guān)死亡原因中高居第二位[1]。盡管手術(shù)和化療等方式在胃癌的治療中取得了較大的進(jìn)展，但發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的晚期胃癌患者的預(yù)后仍然很差[2]。然而，胃癌的發(fā)病機(jī)制目前尚未完全清楚，因此，進(jìn)一步探索胃癌發(fā)病及發(fā)展的分子機(jī)制，尋找及鑒定新的治療靶標(biāo)或預(yù)后標(biāo)志物，對胃癌的治療及預(yù)后具有重要意義。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一種內(nèi)源性、非編碼小RNA，長度為20～25個(gè)核苷酸，能夠通過抑制翻譯或/和切割靶向mRNA來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后的靶基因表達(dá)水平[3-4]。在胃癌中，對miRNA及其功能的研究為其治療策略提供了新的靶點(diǎn)[5-6]。使用生物信息學(xué)重疊亞類分析從癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)庫中找到腫瘤等級(jí)和淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)的胃癌特異性miRNA，其中miR-135b-5p在胃癌組織中表達(dá)異常升高[7]。目前研究顯示，miR-135b-5p與胃癌的發(fā)生、發(fā)展存在相關(guān)性[8-9]。然而，miR-135b-5p在胃癌進(jìn)展中的作用及其調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的潛在機(jī)制尚不清楚。KLF4(Krüppel-like factor 4)基因是一種廣泛存在于多種組織中的鋅指轉(zhuǎn)錄因子，在胃癌的發(fā)病及進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[10]。本實(shí)驗(yàn)前期經(jīng)生物信息學(xué)軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)，miR-135b-5p與KLF4存在靶向結(jié)合位點(diǎn)，因此推測，miR-135b-5p可能通過靶向KLF4調(diào)控胃癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移等生物學(xué)行為。因此本實(shí)驗(yàn)旨在探討miR-135b-5p是否靶向KLF4影響胃癌細(xì)胞生物學(xué)特性。

1 材料與方法

1.1 材料人正常胃黏膜上皮細(xì)胞株GES-1及胃癌SGC-7901、MKN-45、BGC-823、AGS細(xì)胞株均購自美國ATCC公司；RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；青霉素-鏈霉素、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒、胰蛋白酶購自碧云天生物技術(shù)研究所；胎牛血清購自杭州四季青生物材料有限公司；miR-135b-5p inhibitor、miR-135b-5p mimic及對照購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；Trizol提取試劑購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及RT-PCR檢測試劑盒購自日本TaKaRa公司；Transwell小室購自美國Millipore公司；MTT試劑購自美國Sigma公司；Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD公司；Annexin V-FITC雙染色凋亡檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；KLF4抗體及二抗購自美國Abcam公司；引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)人正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1及胃癌SGC-7901、MKN-45、BGC-823、AGS細(xì)胞培養(yǎng)在質(zhì)量濃度為100 g/L胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中加入100 U/ml青霉素和100 g/L鏈霉素，置體積分?jǐn)?shù)為5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞生長狀態(tài)更換新鮮培養(yǎng)基及傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組轉(zhuǎn)染前1 d，將生長狀態(tài)良好的胃癌SGC-7901細(xì)胞以3×103個(gè)/孔接種于6孔板中，于37 ℃恒溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞密度為50%～60%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，將轉(zhuǎn)染miR-135b-5p inhibitor的SGC-7901細(xì)胞記為miR-135b-5p inhibitor組，將轉(zhuǎn)染對照的SGC-7901細(xì)胞記為NC組，不做轉(zhuǎn)染處理的SGC-7901細(xì)胞記為Control組。轉(zhuǎn)染操作步驟按照Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行，轉(zhuǎn)染6 h后更換質(zhì)量濃度為100 g/L胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，在體積分?jǐn)?shù)為5% CO2、37 ℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.4 RT-PCR檢測處于對數(shù)生長期的人胃黏膜上皮GES-1細(xì)胞及胃癌SGC-7901、MKN-45、BGC-823、AGS細(xì)胞采用Trizol法提取細(xì)胞中總RNA，此外，上述轉(zhuǎn)染48 h后的各組SGC-7901細(xì)胞同樣以Trizol法提取細(xì)胞中總RNA。采用核酸蛋白超微量檢測儀測定RNA的純度和濃度，參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，計(jì)算細(xì)胞中miR-135b-5p和KLF4相對表達(dá)水平。miR-135b-5p和KLF4相對表達(dá)水平分別以GAPDH、U6為內(nèi)參。采用2-△△CT法計(jì)算細(xì)胞中miR-135b-5p和KLF4相對表達(dá)水平。所用引物：U6-F：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，U6-R：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。GAPDH-F：5′-GACTCATGACCACAGTCCATGC-3′，GAPDH-R：5′-AGAGGCAGGGATGATGTTCTG-3′。miR-135b-5p-F：5′-GGTATGGCTTTTCATTCCT-3′，miR-135b-5p-R：5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′。KLF4-F：5′-ATGGGCAAGTTCGTGCTGAAGGC-3′，KLF4-R：5′-GCATCTGATCGGGCAGGAAGGAT-3′。

1.5 Western blotting檢測分別收集轉(zhuǎn)染48 h的各組胃癌SGC-7901細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，置冰上提取各組細(xì)胞中總蛋白，采用BCA法對蛋白濃度進(jìn)行檢測，取40 μg蛋白樣品加入到10% SDS-PAGE上樣孔中，110 V恒壓進(jìn)行電泳，待蛋白分離后，采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，在質(zhì)量濃度為50 g/L牛血清白蛋白中封閉1 h，加入KLF4一抗(1∶800稀釋)4 ℃過夜雜交，TBST洗膜3次后再加入二抗(1∶3 000稀釋)室溫孵育2 h。TBST洗膜后，加入ECL化學(xué)發(fā)光液，顯色，以凝膠成像系統(tǒng)讀取圖像，以GAPDH為內(nèi)參，采用Image J圖像分析軟件分析細(xì)胞中KLF4蛋白表達(dá)水平。

1.6 MTT法檢測細(xì)胞增殖能力轉(zhuǎn)染48 h后的各組SGC-7901細(xì)胞分別以MTT法檢測細(xì)胞增殖能力，即在每孔細(xì)胞中加入MTT溶液50 μl，在37 ℃恒溫箱中繼續(xù)孵育4 h，再向每孔細(xì)胞中加入二甲基亞砜200 μl，振蕩反應(yīng)10 min，在酶標(biāo)儀上檢測每組細(xì)胞光密度值(OD值)，檢測波長為490 nm。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，以O(shè)D值反映各組SGC-7901細(xì)胞增殖能力。

1.7 Annexin V/PI檢測細(xì)胞凋亡率收集轉(zhuǎn)染后48 h的各組SGC-7901細(xì)胞，以質(zhì)量濃度為2.5 g/L的胰蛋白酶消化細(xì)胞，離心收集細(xì)胞，以Binding buffer結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，制成1×106ml-1的單細(xì)胞懸液，取100 μl細(xì)胞懸液，分別向細(xì)胞懸液中加入Annexin V-FITC和PI各5 μl，輕輕混勻，室溫避光靜置15 min，采用流式細(xì)胞儀檢測，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，統(tǒng)計(jì)各組SGC-7901細(xì)胞凋亡率。

1.8 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲和遷移能力將各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞接種于24孔板中，接種密度為4×104/孔，常規(guī)培養(yǎng)24 h，將以Matrigel基質(zhì)膠鋪底的Transwell小室放入細(xì)胞培養(yǎng)板中，Transwell小室的上室加入2×104細(xì)胞，Transwell小室的下室加入質(zhì)量濃度為100 g/L胎牛血清的培養(yǎng)基，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。取出Transwell小室，用PBS洗滌3次，以甲醇染色15 min，結(jié)晶紫染色15 min，用棉簽拭去上室細(xì)胞，在顯微鏡下觀察并計(jì)算侵襲至膜下層的細(xì)胞數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，以平均穿膜細(xì)胞數(shù)表示細(xì)胞侵襲能力。以同樣的方法檢測細(xì)胞遷移能力，不同之處在于Transwell小室不以Matrigel涂層，其余均同侵襲實(shí)驗(yàn)。

1.9 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)使用生物信息學(xué)軟件TargetScan預(yù)測miR-135b-5p靶基因結(jié)合位點(diǎn)，預(yù)測結(jié)果顯示，KLF4 3′-UTR與miR-135b-5p能夠靶向結(jié)合，說明KLF4可能是miR-135b-5p的靶基因。分別擴(kuò)增與miR-135b-5p結(jié)合的KLF4 3′-UTR序列及突變序列，分別構(gòu)建野生型載體KLF4 3′UTR-Wt及突變型載體KLF4 3′UTR-Mut，將構(gòu)建好的載體分別與miR-135b-5p mimic及對照共轉(zhuǎn)染至SGC-7901細(xì)胞中，以雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒測定螢火蟲熒光素酶活性及海腎熒光素酶活性，計(jì)算相對熒光素酶活性。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 21.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用單因素方差分析多組間差異，采用SNK-q檢驗(yàn)分析組間差異，每組數(shù)據(jù)代表3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-135b-5p在不同細(xì)胞中的表達(dá)情況通過RT-PCR檢測了人胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1和胃癌細(xì)胞SGC-7901、MKN-45、BGC-823、AGS中miR-135b-5p表達(dá)水平，結(jié)果如表1所示，與GES-1細(xì)胞相比，胃癌SGC-7901、MKN-45、BGC-823、AGS細(xì)胞中miR-135b-5p的表達(dá)水平均顯著上調(diào)(P<0.05)。胃癌SGC-7901細(xì)胞中miR-135b-5p的表達(dá)水平高于胃癌MKN-45、BGC-823、AGS細(xì)胞(P<0.05)，后續(xù)選取SGC-7901細(xì)胞作為轉(zhuǎn)染miR-135b-5p inhibitor的細(xì)胞株。

2.2 在SGC-7901細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-135b-5p inhibitor對miR-135b-5p和KLF4表達(dá)的影響分別將miR-135b-5p inhibitor及對照轉(zhuǎn)染至胃癌SGC-7901細(xì)胞中，48 h后檢測miR-135b-5p的表達(dá)水平，miR-135b-5p inhibitor組SGC-7901細(xì)胞中miR-135b-5p表達(dá)水平顯著低于Control組和NC組(P<0.05)，提示轉(zhuǎn)染miR-135b-5p inhibitor能夠下調(diào)SGC-7901細(xì)胞中miR-135b-5p的表達(dá)。RT-PCR和Western blotting檢測結(jié)果顯示，miR-135b-5p inhibitor組細(xì)胞中KLF4 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯高于Control組和NC組(P<0.05)(見表2、圖1)。提示下調(diào)miR-135b-5p的表達(dá)能夠促進(jìn)KLF4基因的表達(dá)。

表1 RT-PCR檢測胃黏膜上皮細(xì)胞及各胃癌細(xì)胞中miR-135b-5p的表達(dá)水平Tab 1 miR-135b-5p expressions in gastric mucosal epithelial cells and gastric cancer cells detected by RT-PCR

注：與GES-1細(xì)胞相比，*P<0.05；與SGC-7901細(xì)胞相比，&P<0.05。

表2 RT-PCR和Western blotting檢測細(xì)胞中miR-135b-5p和KLF4的表達(dá)水平Tab 2 The expressions of miR-135b-5p and KLF4 in cells detected by RT-PCR and Western blotting

注：與Control組相比，*P<0.05；與NC組相比，&P<0.05。

圖1 Western blotting檢測各組SGC-7901細(xì)胞中KLF4蛋白表達(dá)水平Fig 1 Expression of KLF4 protein in each groupof SGC-7901 cells detected by Western blotting

2.3 下調(diào)miR-135b-5p后對SGC-7901細(xì)胞增殖及凋亡的影響MTT實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示，miR-135b-5p inhibitor組細(xì)胞OD值明顯低于Control組和NC組(P<0.05)，說明下調(diào)miR-135b-5p明顯抑制了胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖能力。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，miR-135b-5p inhibitor組細(xì)胞凋亡率明顯高于Control組和NC組(P<0.05)(見圖2、表3)。說明下調(diào)miR-135b-5p能夠誘導(dǎo)胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組SGC-7901細(xì)胞凋亡率Fig 2 The apoptotic rate of SGC-7901 cells of each group detected by flow cytometry

表3 下調(diào)miR-135b-5p對SGC-7901細(xì)胞OD值及凋亡率的影響Tab 3 Effect of down-regulation of miR-135b-5p on OD value and apoptosis rate of SGC-7901 cells

注：與Control組相比，*P<0.05；與NC組相比，&P<0.05。

2.4 下調(diào)miR-135b-5p后對SGC-7901細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響通過Transwell實(shí)驗(yàn)檢測SGC-7901細(xì)胞侵襲和遷移能力，miR-135b-5p inhibitor組侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)明顯少于Control組和NC組(P<0.05)，說明下調(diào)miR-135b-5p能夠明顯抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞侵襲和遷移(見表4)。

2.5 KLF4是miR-135b-5p的靶基因TargetScan在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測結(jié)果顯示，miR-135b-5p能夠靶向結(jié)合KLF4 mRNA 3′UTR(見圖3A)。將miR-135b-5p mimic、對照分別與野生型載體KLF4 3′UTR-Wt及突變型載體KLF4 3′UTR-Mut共同轉(zhuǎn)入SGC-7901細(xì)胞，結(jié)果顯示，miR-135b-5p mimic與KLF4 3′UTR-Wt共轉(zhuǎn)染組相對熒光強(qiáng)度顯著低于miR-135b-5p對照組(P<0.05)；突變型載體KLF4 3′UTR-Mut轉(zhuǎn)染組間相對熒光強(qiáng)度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見圖3B)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明KLF4是miR-135b-5p直接靶基因。

表4 下調(diào)miR-135b-5p對SGC-7901細(xì)胞侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)的影響Tab 4 Effect of down-regulation of miR-135b-5p on the number of invasion and migration of SGC-7901 cells

注：與Control組相比，*P<0.05；與NC組相比，&P<0.05。

注：與miR-135b-5p NC組相比，*P<0.05。

圖3 miR-135b-5p靶向KLF4驗(yàn)證A：miR-135b-5p靶向結(jié)合KLF4 mRNA 3′UTR示意圖；B：雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

Fig 3 miR-135b-5p targeted KLF4 validationA: miR-135b-5p targeted binding to KLF4 mRNA 3′UTR schematic;B: dual luciferase reporter gene assay

3 討論

目前普遍認(rèn)為miRNA是復(fù)雜生物過程的調(diào)節(jié)因素，已引起很多研究學(xué)者的興趣。目前研究證實(shí)，miRNA可在人類惡性腫瘤中通過靶向下游基因發(fā)揮腫瘤抑制或致癌作用，參與腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移[11]。miR-135b位于1號(hào)染色體上，miR-135b有miR-135b-5p和miR-135b-3p兩種剪切體。目前研究表明，miR-135b在乳腺癌[12]、前列腺癌[13]、肝癌[14]等多種腫瘤中呈高表達(dá)，且與腫瘤臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及分化程度呈顯著相關(guān)性。HUA等[15]研究指出，miR-135b在乳腺癌中表達(dá)上調(diào)，通過調(diào)節(jié)LATS2促進(jìn)細(xì)胞生長。有研究表明，lncRNA GAS5通過抑制miR-135b在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)抑制腫瘤發(fā)生并增強(qiáng)放射敏感性[16]。在骨肉瘤研究中，miR-135b通過靶向FOXO1促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的增殖和侵襲[17]。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，miR-135b-5p過表達(dá)通過抑制胰腺癌中SFRP4的表達(dá)，促進(jìn)臨床特征不良和預(yù)后不良[18]。以上研究提示，miR-135b-5p在腫瘤中發(fā)揮促癌作用。在胃癌研究中，多項(xiàng)研究表明，miR-135b-5p在胃癌組織中呈高表達(dá)，能夠促進(jìn)胃癌生長[19-20]，但其作用機(jī)制目前尚不十分清楚。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常胃黏膜上皮細(xì)胞相比，miR-135b-5p在胃癌細(xì)胞中表達(dá)水平顯著升高。這與先前有關(guān)miR-135b-5p在胃癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)的研究一致。此外，本實(shí)驗(yàn)在胃癌SGC-7901細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-135b-5p inhibitor，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)，下調(diào)miR-135b-5p的表達(dá)后SGC-7901細(xì)胞增殖能力減弱，凋亡率升高，侵襲和遷移能力均受到明顯抑制。以上這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明miR-135b-5p在胃癌進(jìn)展中起關(guān)鍵作用。

為探討miR-135b-5p在胃癌中作用的潛在機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)探究了KLF4是否為miR-135b-5p的直接靶標(biāo)。KLF4是KLF家族鋅指轉(zhuǎn)錄因子的成員，與細(xì)胞增殖、生長停滯和晚期細(xì)胞分化有關(guān)[21-23]。在胃癌中，KLF4的功能已被定性為腫瘤抑制因子，并且可作為患者生存的預(yù)后預(yù)測因子[24]。KLF4的過度表達(dá)顯著抑制胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[25]。本研究首先通過靶基因預(yù)測篩選出KLF4為miR-135b-5p的潛在靶基因。下調(diào)miR-135b-5p的表達(dá)后發(fā)現(xiàn)KLF4 mRNA和蛋白表達(dá)水平均上調(diào)，提示miR-135b-5p可能調(diào)控KLF4的表達(dá)，抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞凋亡。最后雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)了KLF4是miR-135b-5p的直接靶標(biāo)。這些結(jié)果表明，miR-135b-5p的下調(diào)可通過靶向KLF4抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

總之，本研究顯示miR-135b-5p在胃癌細(xì)胞中過表達(dá)與胃癌的發(fā)生和進(jìn)展有關(guān)。miR-135b-5p可促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，抑制細(xì)胞凋亡。為了研究直接靶向機(jī)制，KLF4被鑒定為miR-135b-5p的直接靶標(biāo)。miR-135b-5p通過抑制胃癌中的靶基因KLF4而作為致癌基因發(fā)揮作用。