樊長(zhǎng)征 周偉 張勇鵬

[摘要] 目的 探討補(bǔ)脾清肺方治療下呼吸道耐藥銅綠假單胞菌（PA）感染的作用機(jī)制，為治療PA所致下呼吸道感染提供依據(jù)。 方法 SPF級(jí)雄性SD大鼠，體重240～260 g，2～3月齡，共30只，設(shè)空白對(duì)照組（n = 10），不造模，給予等體積生理鹽水灌服；模型組（n = 10），造模后，給予等體積生理鹽水灌服；中藥組（n = 10），造模后，給予2倍劑量（10.68 g）中藥灌服，以PA液注入大鼠氣管內(nèi)的方法建立大鼠下呼吸道感染模型，以補(bǔ)脾清肺方進(jìn)行干預(yù)。測(cè)定彈性蛋白酶及綠膿菌素含量。 結(jié)果 在彈性蛋白酶含量上，中藥組與模型組比較，中藥組彈性蛋白酶含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；中藥組與空白對(duì)照組比較，中藥組彈性蛋白酶含量升高，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）；模型組與空白對(duì)照組比較，模型組彈性蛋白酶含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。在綠膿菌素含量上，中藥組與模型組比較，中藥組綠膿菌素含量升高，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）；中藥組與空白對(duì)照組比較，中藥組綠膿菌素含量升高，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）；模型組與空白對(duì)照組比較，模型組綠膿菌素含量升高，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。 結(jié)論 補(bǔ)脾清肺方可以顯著減輕氣道炎性反應(yīng)，降低彈性蛋白酶的含量，減輕PA侵襲。

[關(guān)鍵詞] 補(bǔ)脾清肺中藥；中醫(yī)藥治療；耐藥銅綠假單胞菌；下呼吸道感染；毒力因子

[中圖分類號(hào)] R28；R73 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2019）05（a）-0020-05

Effect of Bupi Qingfei Decoction on virulence factors of drug-resistant Pseudomonas aeruginosa

FAN Changzheng1 ZHOU Wei2 ZHANG Yongpeng3 TANG Xudong4 FAN Maorong1 MIAO Qing1 ZHANG Qiong1 YUAN Shasha1

1.Department of Respiration， Xiyuan Hospital of China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100091， China； 2.Department of Respiration， Beijing Chinese Medicine Hospital Pinggu Branch， Beijing 101200， China； 3.Department of Internal Medicine， Huanghua Development Zone Bo′ai Hospital， Hebei Province， Cangzhou 061100， China； 4.China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China

[Abstract] Objective To investigate the mechanism of Bupi Qingfei Decoction in the treatment of drug-resistant Pseudomonas aeruginosa （PA） infection of the lower respiratory tract， to provide evidence for the treatment of PA-induced lower respiratory tract infection. Methods A total of 30 SPF male SD rats， weighing 240-260 g， aged 2-3 months. Blank control group （n = 10） was set， no model was made， and equal volume of normal saline was given. In the model group （n = 10）， normal saline of equal volume was administered after modeling. The rats in the traditional Chinese medicine group （n = 10） were given 2 times the dose （10.68 g） of traditional Chinese medicine after modeling， and the rats′ lower respiratory tract infection model were established by injecting PA solution into rats′ trachea， given Bupi Qingfei Decocion for intervention. The contents of elastase and pyocyanine were determined. Results In terms of elastase content， compared with the model group， the elastase content in the traditional Chinese medicine group decreased， and the difference was statistically significant （P < 0.05）. Compared with the blank control group， elastase content in the traditional Chinese medicine group increased， and the difference was not statistically significant （P > 0.05）. Compared with the blank control group， the elastase content in the model group increased， and the difference was statistically significant （P < 0.05）. In terms of the content of pyocyanine， compared with the model group， the content of pyocyanine increased in the traditional Chinese medicine group， and the difference was not statistically significant （P > 0.05）. Compared with the blank control group， pyocyanine content increased in the TCM group， and the difference was not statistically significant （P > 0.05）. Compared with the blank control group， the content of pyocyanine in the model group increased， and the difference was not statistically significant （P > 0.05）. Conclusion Bupi Qingfei Decoction can significantly improve airway inflammation， reduce the content of elastase and relieve the PA′s invasion.

[Key words] Bupi Qingfei Decoction； TCM treatment； Drug-resistant Pseudomonas aeruginosa； Lower respiratory tract infection； Virulence factor

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）是院內(nèi)下呼吸道感染最常見病原體之一；也是支氣管擴(kuò)張癥等結(jié)構(gòu)性肺病的定植菌，并誘發(fā)反復(fù)感染?，F(xiàn)有抗生素治療對(duì)耐藥PA下呼吸道感染作用有限，從而導(dǎo)致肺衰竭最終導(dǎo)致患者死亡。PA是一種機(jī)會(huì)主義病原體，它利用群體密度感應(yīng)（quorum-sensing，QS）系統(tǒng)來協(xié)調(diào)多種毒力因子的表達(dá)[1]，毒力因子可以幫助病原體侵入并抵抗宿主的防御機(jī)制，增強(qiáng)致病能力。PA產(chǎn)生的毒力因子包括彈性蛋白酶、綠膿菌素和外毒素A等。研究表明，毒力因子產(chǎn)生的毒害與QS系統(tǒng)關(guān)系十分密切[2-3]。PA的耐藥機(jī)制復(fù)雜，是醫(yī)院獲得性感染重要的病原菌，其中彈性蛋白酶、綠膿菌素等毒力因子的表達(dá)是PA耐藥的重要原因之一，同時(shí)PA致病能力的強(qiáng)弱由毒力因子的表達(dá)與變化決定。研究表明，PA的QS系統(tǒng)可以調(diào)控多種毒力因子表達(dá)，如彈性蛋白酶、綠膿菌素等[4]。同時(shí)通過對(duì)QS的研究發(fā)現(xiàn)，PA的毒力因子表達(dá)、生物被膜等眾多致病因子被QS系統(tǒng)控制，特別是彈性蛋白酶的產(chǎn)生受QS系統(tǒng)高度控制，特異性抑制QS系統(tǒng)，能夠在不影響細(xì)菌生存的情況下抑制細(xì)菌的多種毒力因子表達(dá)[5-6]。而從豐富的中醫(yī)藥治療下呼吸道感染臨床經(jīng)驗(yàn)中尋找有效方藥并研究其對(duì)PA毒力因子的影響及機(jī)制有可能為中醫(yī)藥治療下呼吸道耐藥PA感染提供新思路及新方法。據(jù)此，本研究采用PA菌液注入大鼠氣管內(nèi)的方法建立大鼠下呼吸道感染模型，并以此為研究對(duì)象，給予補(bǔ)脾清肺方干預(yù)治療，觀察下呼吸道PA感染模型大鼠氣管肺組織病理學(xué)及檢測(cè)PA的主要毒力因子（彈性蛋白酶、綠膿菌素等）的分泌改變，探索補(bǔ)脾清肺方治療下呼吸道PA感染的初步機(jī)制，為下呼吸道耐藥PA感染中醫(yī)藥防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)健康成年雄性SD大鼠，購(gòu)于斯貝福（北京）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司，體重240～260 g，2～3月齡，許可證號(hào)：SCXX（京）2011-0004。飼養(yǎng)于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，空調(diào)下架式籠養(yǎng)，環(huán)境溫度（23±3）℃，濕度（55±5）%，每天自由飲水（清潔自來水）及進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)飼料。

1.1.2 菌株 PA購(gòu)于中國(guó)藥物檢驗(yàn)所，菌株復(fù)蘇鑒定后培養(yǎng)，監(jiān)測(cè)OD值為600，收獲6×108 CFU/mL新鮮菌供后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.1.3 主要儀器 圖像分析軟件（LOGENE-I醫(yī)用圖像處理系統(tǒng)）；病理切片機(jī)（德國(guó)，LEICA RM2235）；37℃恒溫箱；標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀。普通光學(xué)顯微鏡（日本，OLYMPUS BX41）

1.1.4 主要試劑 大鼠彈性蛋白酶ELISA試劑盒（批號(hào)：JK-ELISA-13082）；氯仿（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20170215）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 模型制作 以PA菌液注入大鼠氣管內(nèi)的方法建立下呼吸道PA感染大鼠模型，造模型大鼠20只，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組大鼠10只，共30只。動(dòng)物均在無菌環(huán)境中飼養(yǎng)。記錄模型的成功率、穩(wěn)定性及均衡性。

下呼吸道PA感染大鼠模型：除空白對(duì)照組外，其余各組大鼠參照本課題組最新建立的下呼吸道PA感染大鼠模型制備方法：大鼠腹腔注射戊巴必妥鈉麻醉后仰臥位固定，選擇唇下3 cm處常規(guī)消毒作縱向1 cm切口，暴露頜下肌群，縱向分離出氣管。選擇甲狀軟骨下較寬的氣管軟骨間隙以微量進(jìn)樣器插入氣管中快速注入0.02 mL（108 CFU/L）PA菌液和l mL氣體，迅速拔出微量進(jìn)樣器并豎起固定板，保持大鼠垂直體位，以緩解呼吸障礙。待大鼠呼吸平穩(wěn)后橫向縫合頸部肌群及皮膚。腹腔注射青霉素3 d，預(yù)防傷口感染。每天以50%葡萄糖液100 mL/kg灌胃3 d。14 d后評(píng)價(jià)模型是否成功。模型成功標(biāo)準(zhǔn)[7]：病理學(xué)可見擴(kuò)張支氣管被覆上皮細(xì)胞增生、脫落；以膿細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞為主的大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；黏膜下層萎縮，平滑肌萎縮、斷裂被纖維組織代替；浸潤(rùn)處形成支氣管炎、支氣管周圍炎、肺炎等斑片狀病灶。

1.2.2 分組設(shè)計(jì) 設(shè)空白對(duì)照組10只，不造模，給予等體積生理鹽水灌服；模型組10只，造模后，給予等體積生理鹽水灌服；中藥組10只，造模后，給予2倍劑量（10.68 g）中藥灌服。對(duì)造模過程中由于操作失誤而致死亡者給予補(bǔ)充。

1.2.3 給藥方案 補(bǔ)脾清肺方組成：黨參20 g、炙黃芪30 g、柴胡10 g、前胡10 g、烏梅10 g、黃連6 g、魚腥草30 g、黃芩15 g、法半夏10 g、茯苓15 g、桔梗12 g、炙甘草10 g。給藥量根據(jù)人與大鼠體表面積換算方法計(jì)算，按人體每日用藥量的2倍劑量給藥。采用配方顆粒進(jìn)行中藥質(zhì)量控制。成人每日生藥量（平均體重50 kg）3.56 g/kg，大鼠每日生藥量（平均體重250 g）21.36 g/kg，1倍劑量=5.34 g。模型成功后，第2天開始灌胃給藥，飼料正常。連續(xù)用藥14 d。

1.2.4 大鼠氣管肺泡灌洗液的采集 最后一次用藥后24 h，各組大鼠腹腔注射戊巴必妥鈉麻醉后仰臥位固定，選擇唇下3 cm處常規(guī)消毒作縱向1 cm切口，暴露頜下肌群，縱向分離出氣管，暴露氣管，結(jié)扎甲狀軟骨端。自甲狀軟骨向氣管內(nèi)注射生理鹽水5 mL，反復(fù)沖洗3次，每只大鼠盡可能抽回沖洗液5 mL作為銅綠假單胞菌培養(yǎng)物，然后進(jìn)行過濾分裝冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 彈性蛋白酶含量測(cè)定 按大鼠彈性蛋白酶的ELISA試劑盒說明進(jìn)行操作。準(zhǔn)備試劑，氣管肺泡灌洗液樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，加入準(zhǔn)備好的樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，37℃反應(yīng)90 min，洗板2次，加入生物素化人血管生成素（ANG）抗體工作液，37℃反應(yīng)60 min，洗板3次，加入ABC工作液，37℃反應(yīng)30 min，洗板5次，加入TMB顯色液，37℃反應(yīng)，加入TMB終止液，30 min內(nèi)讀OD值，計(jì)算標(biāo)本彈性蛋白酶含量。

1.2.6 綠膿菌素測(cè)定 采用氯仿萃取法，步驟如下：取1 mL氣管肺泡灌洗液做PA培養(yǎng)物，取菌液3 mL測(cè)定其OD值600后加入3 mL氯仿萃取，然后在萃取到1 mL的0.2 N的HCl中，得到一個(gè)澄清透明的液體，測(cè)定其在520 nm處OD值，即為菌液綠膿菌素的相對(duì)濃度。相同條件重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 彈性蛋白酶含量測(cè)定

中藥組與模型組比較，中藥組彈性蛋白酶含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；中藥組與空白對(duì)照組比較，中藥組彈性蛋白酶含量升高，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）；模型組與空白對(duì)照組比較，模型組彈性蛋白酶含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）?？瞻讓?duì)照組彈性蛋白酶含量最低，模型組彈性蛋白酶含量最高。見表1。

2.2 綠膿菌素含量測(cè)定

中藥組與模型組比較，中藥組綠膿菌素含量升高，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）；中藥組與空白對(duì)照組比較，中藥組綠膿菌素含量升高，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）；模型組與空白對(duì)照組比較，模型組綠膿菌素含量升高，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。中藥組綠膿菌素最高，空白組綠膿菌素最低。見表2。

3 討論

目前直接殺死細(xì)菌和減弱其毒力是控制PA感染的主要策略。直接殺死細(xì)菌策略被廣泛應(yīng)用，抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，產(chǎn)生細(xì)菌多重耐藥、菌群失調(diào)等多方面的負(fù)面作用。研究者們開始研究減弱細(xì)菌毒力的策略，選擇阻止細(xì)菌的毒力使其無法對(duì)抗宿主免疫防御，進(jìn)而被機(jī)體清除[8]。國(guó)內(nèi)外以干擾群體感應(yīng)系統(tǒng)作為抗菌靶位的新藥物研究試驗(yàn)較多。PA的毒力因子表達(dá)、生物被膜等眾多致病因子被QS系統(tǒng)控制，特別是彈性蛋白酶的產(chǎn)生受QS系統(tǒng)高度控制，特異性抑制QS系統(tǒng)，能夠在不影響細(xì)菌生存的情況下抑制細(xì)菌的多種毒力因子表達(dá)[9-10]。一是海洋藍(lán)藻細(xì)菌提取物，通過干擾LasR活性影響PA毒力。二是抗生素類，如環(huán)丙沙星、阿奇霉素、頭孢他啶等在其亞抑菌濃度下能夠通過干擾細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng)影響PA毒力。三是濃度為5%的人參浸出液，能抑制群體感應(yīng)系統(tǒng)，降低蛋白酶活性影響PA毒力。還有學(xué)者[11]利用群體感應(yīng)系統(tǒng)抑制物選擇器篩選出一些影響群體感應(yīng)系統(tǒng)的非毒性化合物，如純化學(xué)藥品、食物分離物和中草藥等。上述研究均取得了不同程度的研究成果，不過這些研究大多為體外研究，未能在臨床治療中得到試驗(yàn)及運(yùn)用。

中醫(yī)藥治療耐藥細(xì)菌感染方面具有獨(dú)特的作用優(yōu)勢(shì)，臨床中常用中藥聯(lián)合抗生素治療耐藥性PA感染疾病[11]。筆者發(fā)現(xiàn)在古文獻(xiàn)，元代沙圖穆秀克所著《瑞竹堂經(jīng)驗(yàn)方·羨補(bǔ)門》柴前連梅散治療咳嗽日久，咳吐青綠痰病證，效果非常明顯，這與下呼吸道耐藥PA感染患者反復(fù)咳吐青綠痰與之咳嗽日久、咳吐青綠痰病證非常相似。在以上基礎(chǔ)上筆者自擬補(bǔ)脾清肺方用來治療下呼吸道耐藥PA感染，取得了一定效果。本研究團(tuán)隊(duì)回顧總結(jié)了下呼吸道感染90例患者的中醫(yī)證候進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)46.7%的患者存在脾虛證，初步證實(shí)補(bǔ)脾清肺中藥能夠改善患者的免疫功能，減輕癥狀[12]。在此基礎(chǔ)上運(yùn)用補(bǔ)脾清肺中藥（補(bǔ)中柴前連梅煎）治療70例下呼吸道PA感染（支氣管擴(kuò)張癥）患者12周，隨訪12周，試驗(yàn)組的急性加重次數(shù)為0.48次/人，對(duì)照組為0.53次/人，可明顯減少急性加重次數(shù)[13]。前期研究[14]表明補(bǔ)脾清肺方可明顯改善下呼吸道PA感染模型大鼠血管周圍炎性浸潤(rùn)、間質(zhì)性肺炎及細(xì)支氣管支氣管周圍炎性浸潤(rùn)，其作用主要為整體調(diào)理作用。本研究從分子生物學(xué)方面研究補(bǔ)脾清肺方對(duì)下呼吸道PA感染毒力因子的影響機(jī)制。

彈性蛋白酶的毒性作用主要有：①降解人體非膠原蛋、白細(xì)胞膠原等，使肺基底膜完整性受損，致肺氣道物理屏障破壞；②干擾人體免疫應(yīng)答，降解免疫球蛋白IgG和IgA；③干擾纖維細(xì)胞生長(zhǎng)，水解生物被膜內(nèi)部運(yùn)輸孔道[15]；④破壞肺部結(jié)構(gòu)，降解肺彈性蛋白，影響肺部的收縮和舒張，引起肺損傷[16]。綠膿菌素毒性作用[17]主要有：①抑制呼吸道纖毛的功能，使PA在呼吸道更容易定植；②抑制宿主對(duì)病原體的特異性免疫清除；③阻斷細(xì)胞呼吸鏈，致細(xì)胞死亡。潘婷婷等[18]發(fā)現(xiàn)PA的QS基因表達(dá)量越高，彈性蛋白酶的活力越強(qiáng)，毒力作用越強(qiáng)，致病力越強(qiáng)。綠膿菌素分泌量與PA的LasI基因表達(dá)量成正相關(guān)，因此，QS可通過增強(qiáng)PA的彈性蛋白酶活力，使PA進(jìn)一步侵襲宿主，加重患者病情。有兩項(xiàng)研究[19-20]也證實(shí)了LasR和RhlR基因參與了綠膿菌素分泌。本研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)脾清肺方可以降低支氣管擴(kuò)張并PA感染大鼠氣管肺泡灌洗液中彈性蛋白酶的含量，而對(duì)綠膿素的含量無明顯影響，說明補(bǔ)脾清肺方可以降低PA毒力因子彈性蛋白酶的表達(dá)，進(jìn)而改善PA感染，但補(bǔ)脾清肺方如何影響PA群體感應(yīng)系統(tǒng)進(jìn)而降低彈性蛋白酶的表達(dá)需要進(jìn)一步研究。補(bǔ)脾清肺方對(duì)綠膿素的表達(dá)無影響，需要進(jìn)一步研究補(bǔ)中柴前連梅煎對(duì)PA的LasI基因表達(dá)的影響，是否因基因表達(dá)無增加而導(dǎo)致綠膿素含量無增加。

4 小結(jié)

本研究通過補(bǔ)脾清肺方干預(yù)下呼吸道PA感染大鼠模型的反應(yīng)性效應(yīng)及PA毒力因子（彈性蛋白酶含量及綠膿菌素）變化，探討了補(bǔ)脾清肺方治療下呼吸道PA感染的作用機(jī)制，結(jié)果提示補(bǔ)脾清肺方可以顯著減輕氣道炎癥，降低彈性蛋白酶的含量，減輕PA侵襲。仍需進(jìn)一步研究補(bǔ)脾清肺方對(duì)PA群體感應(yīng)系統(tǒng)的影響機(jī)制。

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（收稿日期：2018-10-24 本文編輯：金 虹）