李滿秀， 孫笑笑, 宋志英, 燕琪芳

(忻州師范學院化學系,山西忻州 034000)

金納米粒子(AuNPs)因具有制備簡單、易于表征等特點而受到人們的普遍關注[1 - 2]。鑒于AuNPs比表面積大，吸光系數(shù)高和尺寸依賴等獨特的光學性質，常將其作為發(fā)光物質的能量受體，與能量供體構建熒光共振能量轉移(FRET)體系。如田銳等[3 - 4]以AuNPs為能量受體，羅丹明B或吖啶黃為能量供體，采用FRET方法檢測不同藥物的含量。

妥布霉素是一種氨基糖苷類抗生素，主要對革蘭陰性菌、大腸桿菌、克雷白桿菌、變形桿菌等有效，臨床主要用于敏感細菌引起的嚴重感染。另外，妥布霉素殘留常存在于食物中，比如肉類和牛奶等。目前，測定妥布霉素的方法主要有共振瑞利散射光譜法[5]、分光光度法[6]、離子交換法[7]和高效液相色譜法[8 - 9]等。這些方法各具特點，但亦有一定的局限。本實驗利用AuNPs和加替沙星之間可發(fā)生FRET作用，使加替沙星的熒光猝滅，而妥布霉素可以使加替沙星的熒光得到恢復，基于熒光恢復程度和妥布霉素濃度之間的線性關系，建立了一種操作簡便、靈敏度高的妥布霉素的熒光分析新方法。

1 實驗部分

1.1 主要儀器和試劑

F-4500型熒光分光光度計(日本，日立公司)；UV-2550型紫外分光光度計(日本，島津公司)；85-2型恒溫磁力攪拌器(上海司樂儀器廠)；AL204電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)。

加替沙星儲備溶液(1.0×10-3mol/L)：準確稱取37.5 mg加替沙星標準品(中國藥品生物制定檢定所)，用水溶解后定容到100 mL容量瓶中。妥布霉素儲備溶液(1.0×10-3mol/L)：準確稱取46.8 mg妥布霉素標準品(Aladdin Industrial Corporation)，用水溶解并定容到100 mL容量瓶中。三酸緩沖溶液：由0.04 mol/L H3BO3、H3PO4、HAc組成的混合酸，與不同體積的0.2 mol/L NaOH溶液配制，于酸度計上調至不同pH值。檸檬酸三鈉、氯金酸(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)，妥布霉素滴眼液。實驗用水均為超純水。

1.2 AuNPs的制備

將50 mL 1.0×10-3mol/L氯金酸溶液加入到100 mL的圓底燒瓶中，攪拌并加熱至回流，再向溶液中加入5 mL38.8 mol/L檸檬酸三鈉溶液，溶液快速由淺黃色變成無色到紫黑色，最后變成酒紅色，繼續(xù)加熱回流15 min后停止加熱，待完全冷卻后轉移至棕色容量瓶中，于4 ℃下保存，備用。

1.3 熒光測定

取300 μL 1.0×10-5mol/L加替沙星溶液于10 mL比色管中，再依次加入不同體積的AuNPs溶液和1 mL三酸緩沖溶液(pH=7.0)，用水定容，搖勻，10 min后，以激發(fā)波長335 nm，發(fā)射波長445 nm掃描熒光光譜。取300 μL 1.0×10-5mol/L加替沙星溶液于10 mL比色管中，再依次加入610 μL的AuNPs溶液，不同濃度的妥布霉素溶液，1 mL的三酸緩沖溶液(pH=7.0)，用水定容，搖勻，10 min后，以激發(fā)波長335 nm，發(fā)射波長445nm掃描熒光光譜。儀器激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為10 nm。

1.4 樣品處理

鮮奶：取鮮奶5 mL置于聚丙烯塑料管中，再加入0.5 mL 20%HAc，搖勻，接著加入4.5 mL水，搖勻，放到4 ℃冰箱中1 h(沉淀蛋白)，之后用離心機以3 000 r/min離心10 min，取上清液作為供試液。

妥布霉素滴眼液：取1 mL市售妥布霉素滴眼液于10 mL比色管中，用水定容，作為供試液。

2 結果與討論

2.1 光譜特征

在pH=7.0的三酸緩沖溶液介質中，掃描8.0 μmol/L AuNPs溶液的紫外-可見吸收光譜和熒光光譜，見圖1。AuNPs的最大吸收峰在521 nm處；以361 nm為激發(fā)波長，其最大熒光發(fā)射峰在409 nm處。圖2是按1.3測得30 μmol/L加替沙星的熒光光譜圖，其激發(fā)波長為335 nm，發(fā)射波長為445 nm。根據(jù)文獻方法[10]，用硫酸奎寧作為標準物質，測得加替沙星的熒光量子產率為0.3。

圖1 AuNPs(8.0 μmol/L)的熒光光譜(a)和紫外-可見(UV-Vis)吸收光譜(b)圖Fig.1 Fluorescence spetrum(a) and UV-Vis absorption spectrum(b) of AuNPs(8.0 μmol/L)

圖2 加替沙星(30 μmol/L)的熒光光譜圖Fig.2 Fluorescence spectrum of gatifloxacin(30 μmol/L)

2.2 AuNPs對加替沙星的熒光猝滅作用及機理初探

根據(jù)光譜特征可知，加替沙星在445 nm處有最大熒光發(fā)射峰，而AuNPs在521 nm處有最大紫外吸收峰，加替沙星的發(fā)射光譜和AuNPs的吸收光譜有一定程度的重疊，通過計算可得出光譜重疊面積J=1.12×10-13cm3·L·mol-1,而這成為它們之間發(fā)生熒光共振能量轉移(FRET)的必備條件之一，其中加替沙星是能量供體，AuNPs是能量受體。發(fā)生FRET的結果是加替沙星的熒光猝滅，圖3為AuNPs對加替沙星的熒光猝滅圖。

根據(jù)能量轉移F?rster理論，能量轉移效率E、能量轉移臨界距離R0、供體與受體之間的能量轉移距離r需滿足如下關系:

(1)

(2)

J=ΣF(λ)ε(λ)λ4Δλ/ΣF(λ)Δλ

(3)

公式中，F(xiàn)(λ)為波長λ處熒光供體的熒光強度，ε(λ)為波長λ處受體的摩爾吸光系數(shù)，F(xiàn)為加入能量受體后供體的熒光強度;F0為未加入受體時供體的熒光強度;k2為偶極空間取向因子，取k2=2/3;N為水和有機溶劑的平均折射率(取1.37)，E=0.63。

將計算的J和Φ值帶入公式(1)和(2)，得到R0=4.21 nm，r=3.86 nm，R0和r均小于10 nm，進一步說明加替沙星和AuNPs之間能夠發(fā)生FRET。

2.3 妥布霉素對AuNPs-加替沙星體系的熒光恢復

當AuNPs-加替沙星體系中加入妥布霉素，熒光會得到恢復，原因可能是妥布霉素可以和AuNPs結合生成更穩(wěn)定的復合物，從而破壞了AuNPs與加替沙星之間的FRET，加替沙星得到釋放，其熒光得到恢復。如圖4所示，熒光恢復的強度隨妥布霉素的濃度變化呈線性關系。另外，隨妥布霉素的濃度增大，體系的顏色逐漸由紅色變?yōu)樗{色。

圖3 AuNPs對加替沙星的熒光猝滅圖Fig.3 Fluorescence spectra of gatifloxacin quenched by AuNPs1 - 10:cAuNPs:0，8，13，21，29，37，45，53，61，69 μmol/L，respectively.

圖4 妥布霉素對加替沙星的熒光恢復圖Fig.4 Effect of concentrations of tobramycin on fluorescence of gatifloxacin1 - 8:cTobramycin:0，10，40，80，130，180，230，280 nmol/L，respectively.

2.4 實驗條件優(yōu)化

圖5 pH對體系熒光猝滅率與熒光恢復率的影響Fig.5 Effect of pH on the fluorescencea.Fluorescence quenching rate,b.Fluorescence recovery rate

2.4.1 溶液pH的影響體系的酸度在很大程度上影響AuNPs-加替沙星和妥布霉素之間的作用，配制pH分別為2.6、3.3、4.1、5.0、6.1、7.0、8.4、9.2的三酸緩沖溶液，按實驗方法在相應體系中加入不同的pH緩沖溶液，測定其熒光強度。如圖5所示，AuNPs對加替沙星的熒光猝滅隨pH值的增大基本呈上升趨勢，pH=7.0時達到最大。同樣，妥布霉素對AuNPs-加替沙星的熒光恢復隨pH值的增大先變大后變小，接著又變大，到pH=7.0時達到最大。另外，加替沙星的熒光強度也會隨著pH值的增大而逐漸減小，在堿性體系中比在酸性體系中減小的幅度大。綜合考慮，本實驗選擇在pH=7.0的三酸緩沖溶液中測定體系的熒光強度。

2.4.2 反應溫度的影響考察了反應溫度分別為15、25、35、45、55、65 ℃時，AuNPs對加替沙星熒光猝滅率，以及妥布霉素對熒光恢復率的影響。由實驗可知，加替沙星的熒光強度隨溫度的升高不斷減弱，溫度越低，熒光猝滅越大，而25 ℃時熒光恢復最好。綜合考慮，實驗選擇最佳反應溫度為25 ℃。

2.4.3 反應時間的影響考察了反應時間分別為10、20、30、40、60、90、120 min時AuNPs對加替沙星熒光猝滅，以及妥布霉素對熒光恢復的影響。由實驗結果可知，反應時間在30 min內的熒光猝滅以及熒光恢復最好。實驗選擇反應10 min時進行測量。

2.5 工作曲線、檢出限和精密度

在最佳條件下，AuNPs-加替沙星體系的熒光強度與妥布霉素的濃度在1.0×10-8～2.8×10-7mol/L范圍內呈現(xiàn)良好的線性關系(相關系數(shù)R=0.9917)，線性回歸方程為：F=6.9648c+102.65(c,10-8mol/L)，對4.0×10-8mol/L的妥布霉素進行10次平行測定，相對標準偏差(RSD)為2.0%，以3σ法計算本法對妥布霉素測定的檢出限為6.5×10-9mol/L。

2.6 共存物質的影響

固定混合體系中加替沙星的濃度為3.0×10-7mol/L，AuNPs的濃度為6.1×10-5mol/L，妥布霉素的濃度為4.0×10-8mol/L，考察了可能共存的干擾物質對體系的影響。結果表明，當允許相對誤差為±5%時,各共存物的允許量為：2 500 倍Cu2+、Cd2+、Na+，1 250倍硬酯酸鎂，750倍Fe3+，500倍尿酸、果糖，250倍Co2+、Mn2+、葡萄糖、L-精氨酸，125倍Ni2+,50倍Mg2+，25倍Cr3+、苯酚、淀粉，12.5倍Ag+、Ca2+，5倍半胱氨酸，2.5倍Pb2+。

2.7 樣品測定

采用本方法測定了鮮奶和妥布霉素滴眼液中妥布霉素的含量。分別取處理并稀釋過的樣品溶液，按實驗方法進行測定，同時進行加標回收測定，結果如表1所示。鮮奶樣品的回收率在96.8%～105.0%范圍內，妥布霉素滴眼液樣品的回收率在95.3%～95.6%之間。

表1 樣品及回收率測定

3 結論

本文依據(jù)AuNPs與加替沙星發(fā)生共振能量轉移使加替沙星的熒光猝滅，而在此體系中加入妥布霉素后可使熒光得到恢復，據(jù)此建立了一種簡單、快速、高靈敏度和高選擇性測定妥布霉素的熒光分析新方法。該方法可用于生物樣品中微量妥布霉素的測定。