雷蕾，王璐，姚麗娜，郝心愿，曾建明，丁長慶，王新超，楊亞軍

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茶樹鈣依賴性蛋白激酶基因的鑒定及表達分析

雷蕾，王璐，姚麗娜，郝心愿，曾建明，丁長慶*，王新超*，楊亞軍

中國農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所/國家茶樹改良中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部茶樹生物學與資源利用重點實驗室，浙江 杭州 310008

鈣依賴型蛋白激酶（Calcium-dependent protein kinases，CDPKs或CPKs）是植物細胞中重要的鈣離子信號受體，普遍參與了植物生長發(fā)育和脅迫響應等調(diào)控過程。本研究從茶樹龍井43中克隆到1條基因，經(jīng)測序驗證該序列包含1?611?bp的完整ORF，編碼536個氨基酸。結合序列比對和進化分析發(fā)現(xiàn)該蛋白N-末端具有豆蔻酰化位點，具備鈣依賴性蛋白激酶的保守結構域，并且與擬南芥AtCDPK17的同源關系最近，因此命名為CsCDPK17（Genbank登錄號為：MK238482）。蛋白質(zhì)理化特性分析發(fā)現(xiàn)其蛋白分子量為59.9?kD，理論等電點pI為5.43，屬無跨膜結構域的親水性蛋白。使用水稻原生質(zhì)體和煙草葉片兩種瞬時表達的方法均證明CsCDPK17是細胞質(zhì)膜和細胞核雙定位蛋白。對克隆到的上游2?000?bp的啟動子區(qū)分析發(fā)現(xiàn)了多個與基因轉錄、光、激素（ABA、SA、MeJA等）相關的順式作用元件。表達分析顯示，在成熟葉和種子中表達水平較高，而在根中的表達水平最低；在龍井43、大面白等4個品種冷馴化過程中，該基因的表達隨著冷馴化過程顯著上調(diào)，隨著脫馴化過程下調(diào)；同時還發(fā)現(xiàn)能夠不同程度地響應低溫（最高5.1倍）、干旱（最高2.3倍）、滲透（最高2.4倍）脅迫。本研究的結果表明在茶樹的生長發(fā)育和低溫、干旱、滲透等非生物脅迫響應的過程中均發(fā)揮一定的調(diào)控作用。

茶樹；基因；亞細胞定位；非生物脅迫；表達分析

鈣離子是植物細胞中最重要的第二信使之一，幾乎所有的真核生物細胞中都存在鈣離子信號通路。高等植物中，鈣離子信號通路普遍參與了細胞的生長發(fā)育、脅迫響應等調(diào)控過程[1]。植物細胞膜系統(tǒng)在感受到外界環(huán)境刺激后，首先引起細胞內(nèi)Ca2+濃度的瞬時變化，隨后鈣信號受體感知這種變化并將信號傳遞至下游的調(diào)控網(wǎng)路，進而引起植物細胞內(nèi)的一系列生理、生化變化，完成對各種環(huán)境信號的響應[2]。植物細胞中的鈣離子信號受體主要有鈣調(diào)素（Calmodulins，CaM）及鈣調(diào)素相關蛋白（Calmodulins-related proteins，CML）、類似鈣調(diào)磷酸酶B亞基蛋白（Calcineurin B-like proteins，CBL）和鈣依賴性蛋白激酶（Calcium-dependent protein kinases，CDPK，又稱CPK）三大類[2-3]。與CaM及CML、CBL不同，CDPK在植物細胞中同時發(fā)揮著鈣離子信號受體和傳遞體的雙重功能[4]。鈣依賴性蛋白激酶是一類Ser/Thr型蛋白激酶，通常都是由N-端的可變功能域（N-terminal domain）、蛋白激酶功能域（Protein kinase domain）、自抑制功能域（Autoinhibitory domain）和C端的類鈣調(diào)素功能域（Calmodulin like domain）4個核心功能域構成[1]。其中，C端的類鈣調(diào)素功能域是由成對的螺旋-環(huán)-螺旋狀的EF-hand手型結構組成，Ca2+與EF-手型結構的結合能夠引起CDPK空間結構的改變，從而導致自抑制功能域的抑制作用解除，促使CDPK的蛋白激酶活性恢復，磷酸化下游調(diào)控因子，將信號傳遞至下游調(diào)控網(wǎng)絡，從而完成對生長發(fā)育、環(huán)境刺激等信號的響應[5]。

植物細胞中鈣依賴性蛋白激酶通常是由包含多個成員的基因家族編碼，例如：在擬南芥、水稻、玉米和毛果楊的基因組中分別鑒定出34、31、25個和20個CDPK基因[6-9]。茶樹中，張成才[10]發(fā)現(xiàn)了5條在茶樹花粉中特異表達的CDPK基因，并命名為；Wang等[11]發(fā)現(xiàn)可能參與了茶樹對高溫脅迫的響應。已有研究表明，在各物種響應脅迫的過程中既存在發(fā)揮正向調(diào)控作用的CDPK基因，也存在起負調(diào)控作用的CDPK家族成員。例如：小麥中等基因均受到白粉病誘導表達[12]；水稻中過表達可以顯著提高轉基因植株的低溫抗性[13]；玉米中過表達能夠?qū)е缕浞N子萌發(fā)對ABA更加敏感，同時也能增加轉基因擬南芥對干旱的抗性[14]；而擬南芥突變體表現(xiàn)出比野生型更強的滲透脅迫抗性[15]。

茶樹［(L.) O. Kuntze］起源于熱帶和亞熱帶地區(qū)，是一種喜溫怕寒的多年生常綠木本植物，在其總生育周期和年生育周期內(nèi)都會受到低溫、干旱、高溫等各種環(huán)境因素的影響[16]。近年來，夏季高溫和早春倒春寒災害對我國茶產(chǎn)業(yè)的影響愈發(fā)嚴重，茶樹抗逆育種也成為了當下育種界關注的熱點問題之一。因此，加強對茶樹重要功能基因的挖掘及功能研究，促進茶樹豐富種質(zhì)資源和基因資源的利用是推動茶樹抗逆育種的重要手段之一[17]。在前期工作的基礎上，我們從茶樹中克隆出1條編碼鈣依賴性蛋白激酶的基因，并深入分析了該基因啟動子區(qū)順式作用元件構成，編碼蛋白的理化特性、結構特征和亞細胞定位，檢測了其對多種非生物脅迫的響應情況，以期豐富茶樹CDPK家族的基因信息，也為茶樹非生物脅迫響應過程中信號傳導機制研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

以5年生盆栽（花盆直徑約45?cm，高度約40?cm）的國家級無性系良種龍井43為材料，取其根、莖、成熟葉、頂芽、花和果實用于組織特異性表達試驗，其中花和果實采于2018年10月下旬盛花期間；逆境處理條件如下：盆栽于人工氣候室中適應培養(yǎng)7?d（光周期為14?h光照、10?h黑暗，溫度為白天25℃、夜間22℃），然后開始進行低溫、干旱等非生物脅迫處理。低溫處理時保持光周期不變，調(diào)整溫度為白天4℃、夜間2℃，以低溫處理前為對照，定義為0?h，低溫處理后1、3、6、12、24、48、72?h分別取第1至2片葉為樣品；干旱處理和滲透脅迫處理分別采用聚乙二醇（PEG 6000）和甘露醇模擬，處理時向每一盆栽苗澆灌5%（∶）PEG 6000或者150?mmol·L-1甘露醇1?000?mL，以處理前為對照定義為0?d，處理后的0.5、2、4、6、8?d分別取第1至2片葉為樣品。以田間自然生長的龍井43、大面白、浙農(nóng)12和浙農(nóng)113為材料，在2017—2018年分別于2017年10月14日和12月16日及2018年的1月17日和3月27日取成熟葉用于檢測目標基因在不同茶樹品種冷馴化過程中的表達分析。所有處理均設置3組生物學重復，取樣后立即放入液氮，然后保存于–80℃冰箱備用。

1.2 DNA、RNA的提取及cDNA的合成

分別選用高效植物基因組DNA提取試劑盒（TIANGEN，中國）和RNA prep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（TIANGEN，中國）進行DNA和RNA抽提，具體的操作過程參照試劑盒說明書進行。抽提好的DNA、RNA分別使用Nano Drop ND2000微量核酸蛋白測定儀（Thermo，美國）進行濃度測定和1%變性瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量。經(jīng)檢測合格的DNA保存于–20℃冰箱，用于啟動子克隆；RNA保存于–80℃冰箱，用于cDNA合成。取1?μg RNA使用Prime Script RT Reagent（Takara，日本）反轉錄試劑盒，參照試劑盒說明書完成cDNA合成，保存于–20℃冰箱，用于基因克隆和表達分析等后續(xù)試驗。

1.3 基因CDS全長及啟動子克隆

使用龍井43的cDNA為模板，以在轉錄組中通過同源比對得到的候選序列為參考，設計引物使用RT-PCR進行基因全長克隆驗證?；蚩寺∵x用KOD-Plus-Neo（Toyobo，日本）高保真Taq酶，PCR反應體系為50?μL，包括以下組分：以10倍稀釋的上述cDNA 1.0?μL為模板、10×KOD buffer 5.0?μL、上下游引物各1.5?μL、dNTP 5.0?μL、KOD-Plus-Neo 1.0?μL、MgSO44.0?μL，其余用ddH2O補足。PCR反應程序為：首先經(jīng)94℃預變性3?min；然后98℃變性10?s，56℃退火30?s，68℃延伸90?s，38個循環(huán)；68℃延伸7?min，于4℃保存。反應結束后的RCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，對目標條帶切膠回收，連接到Blunt-zero（TransGen，中國）克隆載體，轉化DH5大腸桿菌，涂板后37℃培養(yǎng)12~14?h，挑取單克隆進行測序驗證?；谝呀?jīng)發(fā)表的舒茶早基因組序列信息[18]，通過比對獲得目標基因轉錄起始位點（ATG）前約2?000?bp的啟動子區(qū)序列，設計引物，以龍井43的DNA為模板進行RT-PCR擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠回收、連接入克隆載體、涂板挑取單克隆測定啟動子區(qū)序列。引物合成和測序由上海華津生物有限公司完成，本研究中涉及的引物及序列見表1。

表1 試驗中用到的引物及其序列

1.4 生物信息學分析

利用DNASTAR 5.01軟件包中的Editseq對目標序列進行ORF預測；在NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）數(shù)據(jù)庫中對其進行同源性比對分析，并根據(jù)文獻中已經(jīng)報道的CDPK基因序列的GeneBank編號，下載氨基酸序列，使用ClustalX 2.0軟件進行多序列比對；采用MEGA 6.0軟件中的鄰接法（Neighbor-Joining tree）構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹（使用Bootstrap檢驗，值為1?000），完成對目標蛋白的進化分析。使用ProtParam（https://web.expasy.org/protparam）預測蛋白分子量、等電點、氨基酸組分等特征；使用ProtScale（https://web.expasy.org/protscale）程序分析該蛋白的疏水和親水性；SignalP（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）分析程序預測該蛋白的信號肽；NetPhos 3.1 Server（www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos）分析程序預測蛋白磷酸化位點；使用Myristoylator（https://web.expasy.org/myristoylator）預測N端的豆蔻?；稽c；使用TMHMM sever 2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0）進行跨膜結構預測；使用SOPMA進行二級結構預測；使用PSORT（https://www.psort.org）進行CsCDPK17蛋白的亞細胞定位預測；SMART（http://smart.embl-heidelberg.de）完成CsCDPK17蛋白的功能與分析；Swiss-Model（https://swissmodel.expasy.org）完成三級結構預測，并用Pymol 2.0.7軟件作圖。使用PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html）完成對啟動子所含順式作用元件的分析。

1.5 CsCDPK17編碼蛋白的亞細胞定位

1.5.1 載體構建

首先，使用帶酶切位點的CsCDPK17-GFP- F/CsCDPK17-GFP-R引物，擴增CsCDPK17編碼序列，切膠回收后備用。然后使用I和I內(nèi)切酶分別對CsCDPK17編碼序列膠回收產(chǎn)物和35s-eGFP載體質(zhì)粒進行雙酶切，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，切膠回收酶切產(chǎn)物。最后將酶切后CsCDPK17編碼序列與載體質(zhì)粒的回收產(chǎn)物使用T4 DNA ligase進行連接，完成CsCDPK17-eGFP載體構建，將構建好的載體轉入DH5，涂板挑選單克隆，經(jīng)菌液PCR驗證陽性克隆后送上海華津生物有限公司測序驗證。

1.5.2 CsCDPK17-eGFP的煙草葉片瞬時表達

將測序驗證正確的CsDPK17-eGFP質(zhì)粒轉化農(nóng)桿菌（GV3101），28℃培養(yǎng)36~48?h后，挑取單克隆進行菌液PCR驗證，將陽性克隆的菌液以1∶1的比例加入50%的甘油于–80℃保存。使用水稻原生質(zhì)體瞬時表達法和煙草葉片瞬時表達的方法進行目標基因的亞細胞定位研究。煙草浸染液制備方式為：首先，取–80℃保存的菌液（GV3101）10?μL于1?mL的LB液體培養(yǎng)基中，28℃，200?r·min-1活化培養(yǎng)3?h；然后，將活化好的菌液按1%比例加入到25?mL（含50?ng·mL-1卡那霉素和50?ng·mL-1利福平）的LB液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)至OD600約1.0（約需要24~36?h）；最后，將培養(yǎng)好的菌液4?000?r·min-1離心10?min，棄去上清，用侵染液（含10?mmol·L-1MES、10?mmol·L-1MgCl2，使用1?mol氫氧化鉀調(diào)pH至5.7）重懸至OD600=0.8，28℃靜置3?h后注射煙草。注射后48?h左右使用激光共聚焦顯微鏡觀察和拍照。

1.6 CsCDPK17的表達分析

2 結果與分析

2.1 CsCDPK17的克隆

使用CsCDPK17-F和CsCDPK17-R引物以龍井43的cDNA為模板成功擴增出1條1?600?bp左右的條帶（圖1），經(jīng)過分析發(fā)現(xiàn)，該序列包含一段全長為1?611?bp的完整開放閱讀框，編碼1條長度為536個氨基酸的蛋白質(zhì)。TAIR數(shù)據(jù)庫中的同源比對結果顯示，該蛋白與擬南芥中的AtCPK17的同源性高達82.5%，其次為AtCPK34，因此，命名該基因為（GenBank登錄號為MK238482）。

圖1 茶樹CDPK家族基因CsCDPK17電泳結果

2.2 進化和保守功能域分析

為了探究該基因與其他物種中已經(jīng)發(fā)表的CDPK蛋白之間的親緣關系，我們使用鄰接法構建了系統(tǒng)發(fā)育進化樹。結果顯示，該進化樹包含有4個亞家族聚類，CsCDPK17與CsCDPK2、CmCDPK2、AtCDPK17等蛋白聚類于第二亞家族（圖2），說明這些蛋白之間具有較近的親緣關系。為了進一步解析CsCDPK17的結構和推測其生物學功能，通過與水稻、擬南芥等模式植物中CDPK氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)，各物種間CDPK在N端序列的差異性較大，符合CDPK的N端是可變結構域的特性（圖3）。N-末端豆蔻酰化位點分析顯示CsCDPK17與AtCPK2、McCDPK2的同源性較高，說明他們可能具有相似的亞細胞定位。蛋白磷酸化預測該蛋白可能有41個磷酸化位點，其中包含20個絲氨酸（Ser）位點、15個蘇氨酸（Thr）位點和6個絡氨酸（Tyr）位點。蛋白質(zhì)結構域分析顯示，CsCDPK17蛋白在其氨基酸序列80~338位之間為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶催化結構域，在C端的385~413、421~449、457~485、492~520這4個位點存在有4個EF-hand手型結構（圖3）。通過與已經(jīng)報道的結構域較為明確的CDPK氨基酸序列[21]比對分析也證實了上述分析結果。綜上，CsCDPK17在激酶結構域、自抑制功能域、ATP結合位點及C端的4個EF-hand手型結構均表現(xiàn)出較高的保守性，推測該蛋白可能具有類似的激酶活性。

2.3 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析及結構預測

CsCDPK17蛋白大小為59.9?kD，理論等電點pI為5.43，化學分子式為C2632H4146N736O813S26。蛋白質(zhì)穩(wěn)定性分析發(fā)現(xiàn)CsCDPK17的脂肪指數(shù)為77.23，不穩(wěn)定系數(shù)為38.60，根據(jù)Guruprasad法判斷該蛋白為穩(wěn)定蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)的親、疏水性通常與功能密切相關，分析顯示該蛋白極性最小負值為–3.011，最大正值為2.756，總平均親水性（GRAVY）為–0.525，屬于親水性蛋白。另外，信號肽的分析顯示CsCDPK17蛋白的S平均值（Mean S-score）為0.100（小于0.5），說明其可能為分泌蛋白；進一步的跨膜結構預測表明，該蛋白不存在跨膜區(qū)，不屬于跨膜蛋白，亞細胞定位預測發(fā)現(xiàn)CsCDPK17可能定位于細胞質(zhì)和細胞核。蛋白質(zhì)空間結構分析表明：-螺旋占41.98%；延伸鏈占9.33%；-轉角占8.58%；無規(guī)則卷曲占40.11%。圖4是CsCDPK17的蛋白質(zhì)空間結構預測模型。

注：McCDPK2：苦瓜；CmCDPK34：甜瓜；CmCDPK2：甜瓜；CsCDPK2：茶樹；CsCDPK17：茶樹；AtCPK17：擬南芥；OsCPK12：水稻；AtCPK21：擬南芥；LeCPK1：番茄；NtCPK1：煙草；OsCPK17：水稻；CsCDPK20：茶樹；OsCPK24：水稻；ZmCPK11：玉米；OsCPK7：水稻；CsCDPK26：茶樹；StCDPK5：馬鈴薯；OsCPK13：水稻；ZmCDPK1：玉米；ZmCPK4：玉米；AtCPK8：擬南芥；AtCPK10：擬南芥；PeCPK10：胡楊；AtCPK16：擬南芥；OsCPK4：水稻；MaCDPK3：野芭蕉

注：兩個藍色箭頭之間的氨基酸序列為蛋白激酶功能域；紅色下劃線表示ATP結合位點，紅色箭頭表示與ATP結合的氨基酸為賴氨酸（K）；黑色下劃線依次表示N端的豆蔻?；稽c、自抑制功能域和C端的4個EF-hand手型結構

圖4 CsCDPK17的3D結構預測模型

2.4 CsCDPK17基因啟動子序列分析

啟動子區(qū)順式作用元件的數(shù)量和種類是基因轉錄水平調(diào)控的重要方式，對克隆出的起始密碼子上游約2?000?bp的啟動子區(qū)進行分析，發(fā)現(xiàn)了多個基因轉錄所必須的元件（如與轉錄起始相關的核心元件TATA-box、CAAT-box等）、多個與光響應相關的元件（如G-box、Box4等）、多個與激素響應相關的元件（如與脫落酸相關的ABRE、與茉莉酸相關的CGTCA-motif元件、與生長素相關的AuxRR-core）等；此外還發(fā)現(xiàn)了多個與非生物脅迫響應、類黃酮代謝相關的TC-rich repeats、MBSI等元件（圖5和表2）。啟動子區(qū)廣泛存在的各種類型的轉錄因子說明該基因可能普遍參與了茶樹的生長發(fā)育和脅迫響應等調(diào)控過程。

2.5 亞細胞定位

使用水稻原生質(zhì)體瞬時表達法對CsCDPK17的亞細胞定位分析發(fā)現(xiàn)，與該蛋白融合的GFP熒光在原生質(zhì)膜和細胞核上均有發(fā)現(xiàn)（圖6），說明該蛋白具有細胞質(zhì)膜和細胞核雙定位。為了進一步確認該定位的準確性，我們又使用了煙草葉片瞬時表達法進行驗證，結果同樣表明CsCDPK17是細胞核和細胞質(zhì)膜雙定位蛋白（圖6）。CsCDPK17在細胞質(zhì)膜和細胞核的雙定位模式說明其在生物學功能上可能同時具有細胞膜信號轉導和核基因表達水平調(diào)控的雙重功能。

2.6 CsCDPK17基因的表達模式分析

2.6.1 組織表達特異性

組織表達特異性檢測結果顯示，基因在各組織中的表達水平均明顯低于內(nèi)參基因。不同組織之間，在成熟葉和種子中的表達水平較高，根中的表達量最低，在第一葉、花、芽、莖中的表達量居中（圖7），表明在成熟葉和種子中呈現(xiàn)出明顯的特異性表達。

2.6.2 不同脅迫處理下的表達模式

對龍井43、大面白、浙農(nóng)12和浙農(nóng)113這4個品種自然冷馴化（越冬）和脫馴化過程的表達情況進行分析。結果發(fā)現(xiàn)，在自然冷馴化期間（10月至次年1月），基因表達水平隨著氣溫逐漸降低而逐漸提高，1月17號時在4個品種中的表達水平均達到最高，并且在4個品種中呈現(xiàn)出相同的表達模式；在脫馴化（次年1月至3月份）過程中，表達水平隨著氣溫的升高又顯著降低（圖8-A）。上述結果說明可能參與了茶樹冷馴化和脫馴化過程的調(diào)控，這也與我們前期發(fā)現(xiàn)的鈣離子信號通路參與了茶樹冷馴化的調(diào)控這一結果相符[22]。

低溫條件下，在茶樹新梢中的表達與4℃低溫處理的時間密切相關，短時間的低溫處理并不能誘導顯著上調(diào)表達，低溫處理24?h后開始顯著上調(diào)表達，約為對照（0?h）的2.2倍；隨著處理時間延長，72?h時表達與對照相比上調(diào)了約5.1倍，上述結果說明的表達受到低溫的誘導（圖8-B）。

干旱脅迫條件下，使用PEG處理2?d后基因的表達顯著上調(diào)，約為處理前的2.3倍，說明參與了干旱脅迫的響應。隨著處理時間的延長，可能是由于茶樹對干旱脅迫產(chǎn)生了一定程度的適應性，表達在處理后的4~8?d逐漸下調(diào)至與處理前無顯著差異的水平（圖8-C）。

注：圖中標注了MYB、MYC結合位點，序號j~s、黑色方框及紅色方框與表2中的順式作用元件相對應

表2啟動子區(qū)域的順式作用元件分析

Fig 2 Analysis of the-acting elements inpromoter region

注：數(shù)據(jù)分析采用Mean with SEM方法，方差分析采用LSD法，柱上小寫字母不同表示差異達顯著水平（P<0.05）

滲透脅迫條件下基因的表達模式與干旱脅迫類似，在處理后的2~4?d基因顯著上調(diào)表達，均達到處理前的2.4倍左右，說明基因也參與了茶樹對滲透脅迫的響應（圖8-D）。

3 討論

本研究從茶樹中克隆到1條與擬南芥AtCPK17同源的鈣依賴性蛋白激酶編碼基因，并命名為。進化樹分析顯示該蛋白聚類于CDPK家族的第二亞家族，具備鈣依賴性蛋白激酶典型的結構域，即N端可變結構域、激酶結構域、自抑制結構域及C端的4個EF-hand手型結構域。通過與其他物種中已經(jīng)報道的CDPK氨基酸序列進行比對發(fā)現(xiàn)，位于CsCDPK17第111號位點的賴氨酸參與激酶與ATP的結合；位于385~413、421~449、457~485和492~520這4個區(qū)域的手型結構可能參與了CsCDPK17與鈣離子的結合[23]。綜合上述生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，CsCDPK17屬于典型的鈣依賴性蛋白激酶。

注：數(shù)據(jù)分析采用Mean with SEM方法，方差分析采用LSD法，柱上小寫字母不同表示差異達顯著水平（P<0.05）。A：冷馴化；B：低溫；C：干旱；D：滲透脅迫

CDPK家族作為最重要的鈣離子信號受體之一，各成員在細胞中的定位并不完全相同。有分析發(fā)現(xiàn)，CDPK蛋白在亞細胞水平的定位受到其N端可變結構域修飾的影響，N端豆蔻酰化有利于CDPK特異性膜靶向定位[24-25]，但是與之直接相關的試驗證據(jù)還不充分。在擬南芥中具有N端豆蔻?；揎椢稽c的AtCPK3/5/20均定位于細胞質(zhì)膜；而不具有該修飾位點的AtCPK4/11/29等蛋白則是定位于細胞質(zhì)和細胞核中[6]；采用點突變的研究發(fā)現(xiàn)N端豆蔻酰化修飾位點突變后AtCPK2/34不再定位于細胞質(zhì)膜[26]。本研究中，通過序列比對發(fā)現(xiàn)CsCDPK17的N-末端具有豆蔻?；稽c（MGNCCS），推測其可能具有細胞質(zhì)膜定位。使用水稻原生質(zhì)體和煙草葉片兩種瞬時表達的方法均證實CsCPK17定位于細胞膜和細胞核，揭示CsCDPK17可能同時參與了細胞膜Ca2+信號轉導和細胞核基因轉錄水平的調(diào)控。

水稻、擬南芥等模式植物中已有的研究表明，CDPK不僅能夠依靠自身的磷酸激酶活性直接參與各種生命活動的調(diào)控，還能夠通過與ABA信號、ROS信號通路互作參與生長發(fā)育和逆境迫響應等過程的調(diào)控[27]。在擬南芥中，有至少12條基因在花器官中特異表達并且參與了花器官發(fā)育的調(diào)控，例如：與野生型相比，雙突變體的花粉管發(fā)育受到嚴重的影響，說明直接參與了花粉管伸長調(diào)控[28]；在不同組織中的表達水平依次為成熟葉、種子、花、第一葉、芽、莖、根，其中在成熟葉和種子的表達水平顯著高于其他器官，說明該基因可能也參與了茶樹中某些組織器官發(fā)育的調(diào)控。

基因?qū)χ参锩{迫響應的調(diào)控作用已經(jīng)被廣泛報道。擬南芥中，通過ABA信號通路介導的氣孔運動增強了轉基因擬南芥對干旱脅迫的抗性[29]。在土豆中，是細胞質(zhì)膜定位的激酶，該蛋白能夠與同樣定位于細胞質(zhì)膜的RBOH蛋白（Respiratory burst oxidase homolog protein）相互作用，直接參與土豆細胞中ROS代謝[30]。過表達水稻能夠抑制細胞內(nèi)ROS的積累，從而增強轉基因水稻對鹽脅迫的耐受性[31]；過表達植株具有更強的低溫抗性，具體表現(xiàn)為脯氨酸含量的增加和GSH/GSSG（還原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽）比率的升高[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，自然冷馴化過程中4個不同抗寒性的茶樹品種中均呈現(xiàn)類似的表達趨勢，說明該基因可能參與了茶樹越冬過程中的自然冷馴化調(diào)控，這一結果也與在成熟葉中表達水平較高和前期研究發(fā)現(xiàn)的鈣離子信號通路參與了茶樹冷馴化過程的調(diào)控[22]等結果相一致。在本研究中的低溫、干旱和滲透等脅迫處理下，均表現(xiàn)出不同程度的誘導表達，說明該基因在茶樹的非生物脅迫響應過程中發(fā)揮有一定的生物學功能。同時，在啟動子區(qū)發(fā)現(xiàn)的參與ABA、MeJA、光等信號響應的順勢作用元件也為該基因生物學功能的解析提供了參考；另外，前面提到CsCDPK17是細胞質(zhì)膜和細胞核雙定位的蛋白激酶，其細胞核定位也與啟動子中發(fā)現(xiàn)的轉錄順勢調(diào)控元件相符合，可在一定程度上調(diào)控下游基因的逆境脅迫響應。在茶樹的生長發(fā)育和脅迫響應等過程中具體的功能、其對鈣離子信號的感知過程、下游的磷酸化底物的種類和數(shù)量以及與ABA、ROS等信號通路之間的關聯(lián)將會是后續(xù)研究的重點。

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Identification and Expression Analysis of Calcium-dependent Protein Kinasein Tea Plant ()

LEI Lei, WANG Lu, YAO Lina, HAO Xinyuan, ZENG Jianming, DING Changqing*, WANG Xinchao*, YANG Yajun

Tea Research Institute of the Chinese Academy of Agricultural Sciences/National Center for Tea Improvement/Key Laboratory of Tea Biology and Resources Utilization, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Hangzhou 310008, China

Calcium-dependent protein kinases (CDPKs or CPKs) are important calcium sensors in higher plants, which are extensively involved in plant development and stress responding. In this study, one sequence that contained a complete ORF of 1?611?bp encoding a 568 amino acids protein was cloned fromcv.Longjing43. Sequence alignments revealed that this protein was a typical plant CDPK possesses N-terminus myristoylation site and protein kinases domain and showed the highest similarity with Arabidopsis. Thus, the gene was defined asbase on further phylogenetic analysis (Genbank accession No. MK238482).Basic protein character analysis shows that CsCDPK17 was a hydrophilic membrane-binding protein with molecularweight of 59.9?kD and PI of 5.43. Further subcellular localization assay using transientexpression in rice protoplasts and tobacco leaves proved that CsCDPK17 was localized in plasma membrane and nucleus. A series of gene transcription, light and hormone (such as ABA, SA, MeJA, etc) responding related-elements were detected in2?000?bp promoter regions. Tissue-specific expression analysis found that high expressions ofwere in the mature leaves and seeds, while the lowest transcription in roots. The transcription ofwas increased during cold acclimation and decreased during de-acclimation procedures in four cultivars with different cold resistance abilities. Moreover, stress induced expression indicated thatcould be induced by cold, drought and osmotic stresses with the highest induction levels of 5.1, 2.3 and 2.4 folds, respectively. Overall, our results suggest that the newly clonedmight be involve in the regulation of both development and abiotic stress responses (such as cold, drought and osmotic stress) in tea plants.

tea plant, CDPK gene, subcellular localization, abiotic stress, expression analysis

S571.1；Q52

A

1000-369X(2019)03-267-13

2018-11-29

2018-12-29

國家自然科學基金（31770735）、現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（茶葉）產(chǎn)業(yè)技術體系（CARS-19）、浙江省農(nóng)業(yè)新品種選育重大科技專項（2016C02053-4）

雷蕾，碩士研究生，主要從事茶樹遺傳育種與抗逆機理研究。*通信作者：chqding@tricaas.com，xcw575@tricaas.com