張夢(mèng)輝 王宏剛 石運(yùn)濤 周靜芳 孫蘇安 劉 露

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院1 消化科，2 病理科，江蘇省淮安市 223300，電子郵箱：zhangmh0520@163.com)

結(jié)腸癌是我國(guó)常見(jiàn)的消化系統(tǒng)腫瘤之一，其預(yù)后與早期診斷和治療密切相關(guān)。結(jié)腸鏡檢查及病理活檢是早期診斷結(jié)腸癌最重要的方法。但不少患者在結(jié)腸鏡檢查發(fā)現(xiàn)腫瘤時(shí)，已處于中晚期，術(shù)后需要輔助化療以提高生存率。目前已有的化療方案有助于延長(zhǎng)結(jié)腸癌患者生存期，但仍需尋找更為有效的靶向分子藥物，以獲得更好的療效。肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light chain kinase，MLCK)是依賴(lài)于鈣調(diào)蛋白的絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶，分為肌型MLCK和非肌型MLCK，廣泛存在于非肌肉性細(xì)胞及真核細(xì)胞中。MLCK的主要功能是使肌球蛋白輕鏈(myosin light chain，MLC)磷酸化，活化肌球蛋白重鏈三磷酸腺苷酶，介導(dǎo)骨架蛋白微絲滑動(dòng)，使細(xì)胞收縮，最終形成細(xì)胞間隙[1]。腫瘤細(xì)胞間隙的形成利于腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移，并使腫瘤細(xì)胞與周?chē)M織連接減弱、腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)增強(qiáng)，促使腫瘤進(jìn)展。有研究顯示，MLCK在子宮肌瘤、卵巢癌、肝癌、乳腺癌等良惡性腫瘤中的表達(dá)相對(duì)升高[2-4]，其參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展，但暫無(wú)結(jié)腸癌組織中MLCK蛋白表達(dá)的研究。本研究探討MLCK蛋白與結(jié)腸癌患者臨床特征的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 回顧性分析2013年6～12月在我院經(jīng)結(jié)腸鏡檢查及外科手術(shù)切除后病理活檢證實(shí)為結(jié)腸癌的63例患者的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有患者的病灶均完整切除，術(shù)后病理證實(shí)為結(jié)腸癌，切緣無(wú)殘留；(2)有完整的臨床資料及生存時(shí)間等隨訪資料；(3)所有患者均為結(jié)腸癌新發(fā)病例，術(shù)前未行放化療等治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)有嚴(yán)重臟器疾病、血液疾病、免疫系統(tǒng)疾病等影響手術(shù)及術(shù)后預(yù)后者；(2)術(shù)后病灶有殘留者；(3)術(shù)前行放化療者。其中男36例、女27例，年齡26～87歲，中位年齡60歲。本研究獲得本院倫理委員會(huì)審查通過(guò)，所有研究對(duì)象均對(duì)本研究知情同意。

1.2 方法

1.2.1 檢測(cè)方法：每例患者術(shù)后取癌組織及癌旁組織各1份，大小0.5 cm×0.5 cm×1.0 cm，石蠟包埋制成蠟塊。委托西安艾麗娜生物科技有限公司在各個(gè)蠟塊中分別取直徑為1.5 mm、厚度為0.5 cm的圓柱形組織條，匯總為一個(gè)新的蠟塊并切片，切片厚度為4 μm，制成組織芯片。采用免疫組織化學(xué)EnVision二步法檢測(cè)MLCK蛋白在結(jié)腸癌組織與癌旁組織中的表達(dá)情況。步驟如下：(1)將石蠟切片置于67℃烘箱中烘片2 h脫蠟，用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)沖洗3次，3 min/次。(2)取檸檬酸鹽緩沖液，微波加熱至沸騰，將脫蠟水化后的組織切片置于耐高溫塑料切片架上，放入已沸騰的檸檬酸鹽緩沖液中，中檔微波處理10 min。(3)取出微波盒于流水中自然冷卻，取出玻片，蒸餾水沖洗2次，再用PBS沖洗2次，5 min/次。(4)每張切片滴加0.3%過(guò)氧化氫，室溫下孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性，PBS沖洗3次，5 min/次后，每張切片滴加MLCK一抗(武漢博士德生物公司，批號(hào)：BM4290，工作濃度為1 ∶1 000)，室溫下孵育2 h。(5)PBS沖洗3次，5 min/次，除去PBS，每張切片滴加聚合物增強(qiáng)劑，室溫下孵育20 min。(6)PBS沖洗3次，5 min/次，除去PBS液，每張切片滴加EnVisionTM檢測(cè)試劑(Dako公司，批號(hào)：GK500705)，室溫下孵育30 min。(6)PBS沖洗3次，5 min/次后，每張切片滴加二氨基聯(lián)苯胺液，蘇木素復(fù)染，自來(lái)水沖洗，熱水藍(lán)化，電吹風(fēng)干燥，中性樹(shù)膠封固，最后置于顯微鏡下觀察。

1.2.2 MLCK表達(dá)的判定：由2位病理醫(yī)師采用雙盲法觀察組織芯片的染色情況，根據(jù)染色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞比例綜合計(jì)分。在400倍顯微鏡下隨機(jī)觀察5個(gè)視野，以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)淡黃色、棕黃色或棕褐色顆粒為MLCK陽(yáng)性細(xì)胞，分別計(jì)1分、2分、3分，染色陰性計(jì)0分。按陽(yáng)性細(xì)胞比例進(jìn)行評(píng)分：0分(陽(yáng)性細(xì)胞比例≤5%)，1分(5%<陽(yáng)性細(xì)胞比例≤25%)，2分(25%<陽(yáng)性細(xì)胞比例≤50%)，3分(50%<陽(yáng)性細(xì)胞比例≤75%)，4分(75%<陽(yáng)性細(xì)胞比例≤100%)。根據(jù)兩項(xiàng)分?jǐn)?shù)的乘積將MLCK的表達(dá)情況分為4級(jí)，分?jǐn)?shù)≤4分記為-，5～8分記為+，9～12分記為++，>12分記為+++。其中-為表達(dá)陰性；+、++、+++為表達(dá)陽(yáng)性。根據(jù)MLCK的表達(dá)情況，將患者分為MLCK陽(yáng)性表達(dá)組和MLCK陰性表達(dá)組，分析MLCK表達(dá)情況與結(jié)腸癌臨床病理特征的關(guān)系。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分比表示，比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 MLCK蛋白在結(jié)腸癌組織與癌旁組織中的表達(dá) 在63例結(jié)腸癌組織中，MLCK表達(dá)陽(yáng)性52例，陽(yáng)性率為82.5%，染色部位均位于胞漿；而63例癌旁組織中，MLCK表達(dá)陽(yáng)性30例，陽(yáng)性率為47.6%。癌旁組織中MLCK表達(dá)陽(yáng)性率低于癌組織(χ2=16.092，P<0.001)。

2.2 MLCK蛋白表達(dá)情況與結(jié)腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系 MLCK表達(dá)陽(yáng)性組的中位年齡為59歲，表達(dá)陰性組的中位年齡為68歲，兩組年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-1.884，P=0.060)。兩組的性別、腫瘤發(fā)生的部位、腫瘤大小、病理分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及浸潤(rùn)腸壁全層情況比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 MLCK表達(dá)與結(jié)腸癌臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

3 討 論

在腫瘤細(xì)胞中，多種信號(hào)通路共同參與MLCK的活化，其中大多通過(guò)絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路的細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase,ERK)1/2、P38、c-Jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)途徑，以及炎癥相關(guān)路徑參與細(xì)胞的增殖、凋亡過(guò)程。尤嘉琮[5]發(fā)現(xiàn)，ERK磷酸化可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖和遷移，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與ERK1/2-MLCK-p-MLC、ERK1/2-Survivin和ERK1/2-β-連環(huán)蛋白-細(xì)胞周期蛋白D1密切相關(guān)，P38/MLCK參與抗腫瘤細(xì)胞的凋亡。左莉[6]將MLCK抑制劑ML-7作用于結(jié)腸癌細(xì)胞并構(gòu)建MLCK敲除模型(siMLCK)發(fā)現(xiàn)，癌細(xì)胞克隆、遷移率降低，且構(gòu)建ERK1敲除模型后MLCK mRNA和蛋白表達(dá)明顯降低，提示ERK1/MAPK信號(hào)通路可調(diào)節(jié)MLCK的表達(dá)。炎癥相關(guān)結(jié)腸癌的發(fā)病與炎癥因子、氧化應(yīng)激、腸道微生態(tài)及基因改變等有關(guān)[7]，炎癥細(xì)胞、炎癥因子與腫瘤的增殖、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移有關(guān)[8]。腫瘤壞死因子通過(guò)活化核轉(zhuǎn)錄因子κB來(lái)介導(dǎo)MLCK啟動(dòng)子活性增加，從而引起腸上皮功能障礙[9]。

有學(xué)者認(rèn)為，MAPK信號(hào)通路調(diào)控MLCK從而改變癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力[10]。Barkan等[11]發(fā)現(xiàn)，癌細(xì)胞由休眠變?yōu)樵鲋碃顟B(tài)依賴(lài)于纖連蛋白的產(chǎn)生和整聯(lián)蛋白β的信號(hào)傳導(dǎo)，MLCK通過(guò)與整合素β作用使MLC磷酸化和形成絲狀肌動(dòng)蛋白應(yīng)力纖維。MLCK不僅可通過(guò)收縮骨架蛋白使細(xì)胞變形而參與細(xì)胞遷移，還可活化下游信號(hào)分子使細(xì)胞外基質(zhì)降解來(lái)參與腫瘤細(xì)胞的脫落[12]。馬小艷等[3]用MLCK siRNA的病毒載體感染人卵巢癌細(xì)胞株構(gòu)建出MLCK表達(dá)下調(diào)模型，發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞的遷移能力明顯下降，進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)核轉(zhuǎn)錄因子κB的亞單位p65及其下游分子金屬基質(zhì)蛋白酶2表達(dá)降低，提示MLCK可通過(guò)活化核轉(zhuǎn)錄因子κB及金屬基質(zhì)蛋白酶2表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)腫瘤遷移。然而，Lee等[13]發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸癌組織中MLCK mRNA表達(dá)量較正常組織減少；譚翔等[14]的研究顯示MLCK mRNA及MLC蛋白9在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)明顯降低，但在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中明顯升高。研究表明，肌球蛋白輕鏈激酶假基因在肺癌及結(jié)腸癌組織高表達(dá)，其可導(dǎo)致mRNA不穩(wěn)定并抑制其表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移[15]，但目前肌球蛋白輕鏈激酶假基因?qū)LCK蛋白表達(dá)的影響尚不清楚，暫未檢索到MLCK蛋白在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)情況的研究。本研究結(jié)果顯示MLCK蛋白在結(jié)腸癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率高于癌旁組織(P<0.05)。提示MLCK基因與腫瘤的遷移有關(guān)，但本研究發(fā)現(xiàn)MLCK蛋白表達(dá)與結(jié)腸癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)相關(guān)性，且與患者年齡、性別、腫瘤發(fā)生部位、腫瘤大小、浸潤(rùn)腸壁全層情況、腫瘤病理分級(jí)均無(wú)相關(guān)性(均P>0.05)，這提示MLCK蛋白參與結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制仍不明確。但研究顯示MLCK蛋白可調(diào)控結(jié)腸上皮細(xì)胞的連接緊密性，從而影響腸黏膜的通透性，因此其對(duì)腸道炎癥、腫瘤、菌群平衡均有重要影響[16]。

綜上所述，MLCK蛋白在結(jié)腸癌組織和癌旁組織中存在差異表達(dá)，但具體分子機(jī)制不明，仍有待進(jìn)一步開(kāi)展結(jié)腸癌細(xì)胞的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)加以闡明。本課題組擬增加結(jié)腸癌樣本量，并納入潰瘍性結(jié)腸炎患者進(jìn)行分析，建立隨訪數(shù)據(jù)庫(kù)，研究MLCK蛋白在腸道炎癥與炎癥相關(guān)結(jié)腸癌發(fā)病中的作用，探索小分子靶向藥物MLCK抑制劑ML-7對(duì)結(jié)腸炎癥和腫瘤的防治作用。