呂 鋒 馮繼峰

(廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院廂竹院區(qū)麻醉科，南寧市 530002，電子郵箱：13206945@qq.com)

地氟烷是血/氣分配系數(shù)最小的吸入麻醉藥，麻醉誘導和蘇醒均很迅速，并可精確調(diào)控肺泡藥物濃度和快速調(diào)節(jié)麻醉深度[1]。地氟烷可促進腦缺血大鼠的神經(jīng)功能恢復，降低腦梗死和缺血再灌注損傷的面積，其機制可能與抑制線粒體腫脹和膜電位耗散有關(guān)[3-5]。最近有研究表明，地氟烷可通過干擾CXC受體(CXC receptor,CXCR)2信號通路來減弱CXC細胞因子誘導的中性粒細胞炎癥反應[6]。脂多糖是導致膿毒癥的常見內(nèi)毒素，可引起明顯的肺損傷，但目前鮮見有關(guān)地氟烷預處理是否能減輕脂多糖所致肺損傷的研究報道。因此，本研究建立幼年大鼠的脂多糖所致肺損傷模型，探討地氟烷預處理對脂多糖所致肺損傷的干預效果及其機制。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑 UV-2100PC型紫外可見分光光度計由美國Unico公司生產(chǎn)，RF-510型熒光分光光度計由日本島津公司生產(chǎn)，55P-7型超速離心機由日本東芝公司生產(chǎn)。大腸桿菌脂多糖(批號：S17 32～25 mg)、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA；批號：P0012)、活性氧簇(reactive oxygen species,ROS；批號：S0033)和線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP；批號：C2006)試劑盒均由上海碧云天生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，白細胞介素(interleukin,IL)-1β(批號：CSB-E08055r)和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α(批號：CSB-E11987r)酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒由武漢華美生物工程有限公司生產(chǎn)，RNAiso Plus(批號：9108)試劑、反轉(zhuǎn)錄PrimeScriptTMRT reagent Kit(Perfect Real Time)(批號：RR037A)試劑盒、PCR TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus；批號：RR820A)試劑盒均由日本TaKaRa公司生產(chǎn)，CXCR1多克隆抗體(批號：bs-1009R)、CXCR2多克隆抗體(批號：bs-1629R)、CD11b多克隆抗體(批號：bs-1014R)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)多克隆抗體(批號：bs-2188R)和辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(bs-0295G)均由美國Bioss公司生產(chǎn)。

1.2 實驗動物及分組 清潔級健康雄性Wistar大鼠60只，購于廣東省醫(yī)學實驗動物中心[(許可證號：SCXK(粵)2013-0002)]，18日齡，體重160～180 g，飼養(yǎng)于鼠籠內(nèi)，自由進食和飲水。采用隨機數(shù)字表法將大鼠分為對照組(C組)、脂多糖組(L組)、1.0 最大允許濃度(maximum allowable concentration,MAC)地氟烷組(D1.0組)和1.5 MAC地氟烷組(D1.5組)，每組15只。本實驗中所有實驗動物處置方法均符合動物倫理學標準。

1.3 建立脂多糖肺損傷模型[7]D1.0組和D1.5組建模前分別吸入1.0 MAC和1.5 MAC地氟烷40 min。L組、D1.0組和D1.5組大鼠氣管內(nèi)滴注脂多糖，劑量均為5.0 mg/kg，C組氣管內(nèi)滴注等量生理鹽水。

1.4 標本制備 滴注脂多糖或生理鹽水8 h后，采用80 mg/kg氯胺酮和60 mg/kg戊巴比妥鈉行腹腔注射以麻醉大鼠，暴露胸腔，右心室取血，1 800 r/min、4℃離心15 min后留取血清；結(jié)扎右肺，反復灌洗支氣管肺泡，收集支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)。血清、BALF和肺組織置于-80℃保存待檢。

1.5 觀察指標

1.5.1 肺組織濕/干比：取右肺下葉組織稱取濕重，置60℃烘干箱48 h后稱取干重，計算濕/干比值評估肺水腫程度。

1.5.2 肺組織病理學觀察：取右肺中葉組織以10%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片，蘇木素-伊紅(hematoxylin and eosin,HE)染色，光鏡下觀察肺組織病理學改變并評分。評分內(nèi)容包括肺泡充血、出血、白細胞滲出到肺泡腔或血管壁、肺泡壁損傷，均分別按照0～4分進行評分，其中少量輕微損傷為0分，輕度損傷為1分，中度損傷為2分，重度損傷為3分，嚴重損傷為4分，病理學評分為各項評分之和[8]。

1.5.3 炎癥因子含量的檢測：采取ELISA檢測血清和BALF中IL-1β和TNF-α的含量，均按照試劑盒說明書進行操作。

1.5.4 肺組織ROS和MMP耗散情況的檢測：取右肺上葉肺組織，制備細胞勻漿后，按照ROS檢測試劑盒說明書進行操作，以Rosup試劑作為活性氧陽性對照。參照文獻[4]的方法，將分離的線粒體(0.5 mg蛋白/mL)置于225 mmol/L甘露醇(1.0 mL)、70 mmol/L蔗糖(1.0 mL)和5 mmol/L Hepes分析緩沖液(1.0 mL)中，加入40 μmol/L氯化鈣1.0 mL，誘發(fā)羅丹明123的釋放(測定條件：25℃，0.3 mol/L羅丹明123，激發(fā)和發(fā)射波長分別為503 nm和525 nm)，MMP耗散以加入羅丹明123前后的熒光強度變化絕對值表示。

1.5.5 實時熒光定量PCR反應檢測肺組織CXCR1、CXCR2和CD11b mRNA的表達：取左肺上葉肺組織，采用TRIzol試劑提取肺組織中的總RNA，按試劑盒說明進行反轉(zhuǎn)錄后，按照PCR試劑盒的操作步驟進行PCR反應，反應體系包括2×One Step TB Green實時熒光PCR Buffer 4 12.5 μL、PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 2 2.0 μL、PCR forward Primer(10 μM)2.0 μL、PCR reverse Primer(10 μM)2.0 μL、ROX Reference Dye or Dye Ⅱ(50×)1.0 μL、Total cDNA 4.0 μL和RNase Free dH2O 1.5 μL。CXCR1、CXCR2、CD11b和內(nèi)參GAPDH引物序列均由日本TaKaRa公司合成。采用相對定量法2-△△Ct計算各基因mRNA的表達水平，其中△Ct=目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值。

1.5.6 蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測CXCR1、CXCR2和CD11b蛋白的表達：取左肺下葉肺組織，提取肺組織的總蛋白，BCA法測定蛋白濃度后，經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉后，多克隆CXCR1、CXCR2和CD11b抗體(一抗，比例分別為1 ∶1 000、1 ∶500和1 ∶500)4℃孵育過夜，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(二抗，比例為1 ∶1 000)室溫孵育1 h。采用電化學發(fā)光試劑盒顯影，ChemiDocTMMP成像系統(tǒng)成像并檢測灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參GAPDH 的灰度值比值代表各組目的蛋白的相對表達量。

1.6 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以(x±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 4組大鼠肺組織濕/干比比較 與C組比較，L組、D1.0組和D1.5組大鼠肺組織濕/干比均增加(均P<0.05)；與L組比較，D1.0組和D1.5組大鼠肺組織濕/干比均降低(均P<0.05)；而D1.0組和D1.5組大鼠肺組織濕/干比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 4組肺組織濕/干比、病理學評分、ROS陽性率和MMP耗散的比較(x±s)

注：與C組比較，aP<0.05；與L組比較，bP<0.05。

2.2 4組大鼠肺組織病理學改變和評分比較 C組大鼠肺組織無明顯病理學改變；D1.0組和D1.5組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)輕度紊亂，肺組織及肺間質(zhì)部分充血水腫，肺泡可見炎癥細胞和紅細胞滲出；L組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)明顯紊亂，肺組織及肺間質(zhì)充血水腫明顯，肺泡內(nèi)大量炎性細胞和紅細胞滲出。見圖1。與C組比較，L組、D1.0組和D1.5組大鼠肺組織病理學評分升高(均P<0.05)；與L組比較，D1.0組和D1.5組大鼠肺組織病理學評分降低(均P<0.05)；而D1.0組和D1.5組大鼠肺組織病理學評分差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

圖1 光鏡下觀察大鼠肺組織病理學改變(HE染色，100×)

2.3 4組大鼠ROS陽性率和MMP耗散比較 與C組比較，L組、D1.0組和D1.5組大鼠肺組織ROS陽性率和MMP耗散增加(均P<0.05)；與L組比較，D1.0組和D1.5組大鼠肺組織ROS陽性率和MMP耗散降低(均P<0.05)；而D1.0組和D1.5組大鼠肺組織ROS陽性率和MMP耗散差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

2.4 4組大鼠血清及BALF炎癥因子表達水平比較 與C組比較，L組、D1.0組和D1.5組大鼠血清及BALF中TNF-α和IL-1β水平均增加(均P<0.05);與L組比較，D1.0組和D1.5組血清及BALF中TNF-α和IL-1β水平均降低(均P<0.05)；D1.0組和D1.5組大鼠血清及BALF中TNF-α和IL-1β水平差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血清和BALF炎癥因子IL-1β和TNF-α水平的比較(x±s)

注：與C組比較，aP<0.05；與L組比較，bP<0.05。

2.5 4組大鼠肺組織CXCR1、CXCR2和CD11b mRNA和蛋白的表達水平比較 與C組比較，L組、D1.0組和D1.5組大鼠肺組織中CXCR1、CXCR2和CD11b mRNA和蛋白表達水平均增加(均P<0.05);與L組比較，D1.0組和D1.5組肺組織中CXCR1、CXCR2和CD11b mRNA和蛋白表達水平均降低(均P<0.05)；D1.0組和D1.5組肺組織中CXCR1、CXCR2和CD11b mRNA和蛋白表達水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。見表3和圖2。

表3 各組大鼠肺組織CXCR1、CXCR2和CD11b mRNA和蛋白表達水平比較(x±s)

注：與C組比較，aP<0.05；與L組比較，bP<0.05。

圖2 4組大鼠肺組織CXCR1、CXCR2和CD11b蛋白的表達情況

3 討 論

本研究中，L組大鼠經(jīng)0.5 mg/kg脂多糖作用8 h后，肺泡及肺泡壁結(jié)構(gòu)紊亂，肺間質(zhì)水腫，肺泡內(nèi)見大量紅細胞和炎細胞浸潤，且肺組織濕/干比、血清及BALF中IL-1β和TNF-α水平均較C組升高(均P<0.05)。這提示大鼠肺組織發(fā)生水腫和急性炎癥性損傷，脂多糖致肺損傷模型建立成功。預先給予地氟烷處理40 min的D1.0組和D1.5組大鼠肺組織濕/干比、病理學評分、血清及BALF中TNF-α和IL-1β水平均低于L組(P<0.05)，肺組織水腫、病理損傷均減輕，但D1.0組和D1.5組間差異無統(tǒng)計學意義，提示地氟烷預處理可能起到抗炎癥和肺保護作用且不隨地氟烷的濃度變化而改變。

脂多糖刺激肺組織分泌炎性介質(zhì)、產(chǎn)生ROS以及引起氣道上皮損傷，是其導致急性肺損傷的重要機制。正常情況下，機體內(nèi)氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)是平衡的，不斷產(chǎn)生ROS以維持生理功能，并被抗氧化系統(tǒng)清除。當產(chǎn)生的ROS超出抗氧化系統(tǒng)的清除能力，出現(xiàn)氧化應激反應，即引起組織器官損傷[9]。急性肺損傷時，中性粒細胞和肺泡巨噬細胞釋放大量的ROS，引起脂質(zhì)過氧化反應、抑制線粒體呼吸鏈酶和膜鈉通道活性等，進一步加重肺組織炎癥反應和損傷[10-11]。本研究結(jié)果顯示，D1.0組和D1.5組大鼠肺組織ROS陽性率低于L組(均P<0.05)，但D1.0組和D1.5組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，提示地氟烷預處理后可一定程度抑制肺組織ROS的產(chǎn)生，且無濃度依賴性。

MMP耗散是細胞能量代謝嚴重障礙的結(jié)果，在一定程度上反映細胞凋亡和壞死[12]。張兵等[4]的研究結(jié)果提示，1.0 MAC和1.5 MAC的地氟烷均可抑制腦缺血再灌注導致的MMP耗散和Ca2+導致的線粒體腫脹，但這種變化不呈劑量依賴性。本研究中，D1.0組和D1.5組大鼠肺組織MMP耗散均低于L組(均P<0.05)，提示地氟烷也可抑制脂多糖所致大鼠肺損傷模型的MMP耗散，這可能是地氟烷可以抑制脂多糖所致肺損傷引起的氧化應激和炎癥反應；但D1.0組和D1.5組大鼠肺組織MMP耗散差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，提示地氟烷的抑制作用亦無濃度依賴性。

中性粒細胞募集是脂多糖所致肺損傷和炎癥反應發(fā)展的關(guān)鍵病理生理過程。攜帶C-X-C-基序的前炎癥細胞因子包括IL-8及其激活的CXC-配體1和CXCR2，可促進依賴CD11b的中性粒細胞遷移[13-15]。因此，CXCR2信號通路是減輕脂多糖誘導急性肺損傷的重要途徑。有研究表明，麻醉藥地氟烷可通過干擾CXCR2信號通路的傳導降低CXC炎癥因子的釋放和減輕中性粒細胞炎癥反應[6]。本研究結(jié)果顯示，D1.0組和D1.5組大鼠肺組織CXCR1、CXCR2和CD11b mRNA和蛋白表達水平均低于L組(均P<0.05)，提示地氟烷可抑制CXCR2信號通路的激活，從而減少CXC炎癥因子的釋放和減輕中性粒細胞炎癥反應。

綜上所述，地氟烷預處理可減輕幼年大鼠脂多糖所致的肺損傷和炎癥反應，其機制可能是通過干擾CXCR2信號通路減少ROS生成和MMP的耗散。