劉寧寧 馮 蓓 段 偉 李紅霞

(延安大學(xué)附屬醫(yī)院1 腫瘤科，2 婦科，陜西省延安市 716000，電子郵箱：283132024@qq.com)

宮頸癌的死亡率在婦科腫瘤中居第二位，發(fā)病率約占所有婦科腫瘤的10%[1]。由于宮頸癌發(fā)病早期的臨床表現(xiàn)不典型，因此，患者就診時(shí)已多為晚期，導(dǎo)致死亡率一直居高不下[2-3]。研究表明，宮頸癌是多基因共同作用失衡的結(jié)果，而隨著腫瘤分子生物學(xué)研究的發(fā)展，人們對(duì)腫瘤發(fā)生與發(fā)展分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)不斷加深，為腫瘤的分子靶向治療提供了一個(gè)全新的方向和目標(biāo)[4-5]。黏著斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)是一種非受體胞漿酪氨酸激酶，在調(diào)節(jié)細(xì)胞生存、凋亡、黏附、侵襲、遷移等方面發(fā)揮重要作用[6-7]。FAK在乳腺癌、宮頸癌、直腸癌、甲狀腺癌等惡性腫瘤中呈高表達(dá)狀態(tài)，并且與腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲密切相關(guān)[8-9]。FAK下游信號(hào)通路有FAK-絲裂原活化蛋白激酶通路、FAK-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子通路、FAK-磷脂酰肌醇3激酶通路，介導(dǎo)細(xì)胞增殖、侵襲、凋亡等生物學(xué)特性的改變[10]。RNA干擾是一種正常生物體內(nèi)抑制特定基因表達(dá)的現(xiàn)象，可特異性下調(diào)特定基因的表達(dá)，在惡性腫瘤、遺傳性疾病中廣泛應(yīng)用[11]。構(gòu)建帶有抗性基因的小干擾核糖核酸(small interfering RNA，siRNA)質(zhì)粒載體，可使目的基因整合入腫瘤細(xì)胞染色體中，從而獲得穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，有利于RNA干擾某一基因?qū)?xì)胞生物學(xué)的影響[12]。本文探討RNA干擾FAK表達(dá)對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移能力、細(xì)胞凋亡及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)相對(duì)表達(dá)量的影響，為宮頸癌的基因治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究材料 宮頸癌HeLa細(xì)胞株由我院中心實(shí)驗(yàn)室提供，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pSuper-Retro由我院病理生理醫(yī)學(xué)部惠贈(zèng)，β-肌動(dòng)蛋白抗體(批號(hào)：20189592，1 ∶1 000)及辣根過(guò)氧化物酶(hoseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記羊抗兔二抗(批號(hào)：20148462，1 ∶10 000)均購(gòu)自上海生工公司，抗Caspase-3抗體(批號(hào)：20191233，1 ∶1 000)、抗FAK抗體(批號(hào)：20164344，1 ∶1 000)均購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。

1.2 RNA干擾FAK表達(dá)體系的建立 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)提供的FAK基因序列，按siRNA的序列設(shè)計(jì)siRNA引物，正義鏈序列：5′-GATCCGCCACCTGGGCCAGTATTATTTCAAGACGATAATACTGGCCCAGGTGG-3′，反義鏈序列：3′-GCGGTGGACCCGGTCATAATAAAGTTCTGCTATTATAGCCGGTCCACC-3′，引物由上海生工公司合成。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 用含10%小牛血清的DMEM在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HeLa細(xì)胞株，培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后將其制備為單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞種植于6孔板中培養(yǎng)，每孔接種1×105個(gè)，取8 μL脂質(zhì)體LipofectamineTM2000加入250 μL無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基中，并置于一消毒的EP管，混勻后室溫孵育10 min；其中觀察組取4 μg RNA干擾FAK表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，陰性對(duì)照組采用同樣方法轉(zhuǎn)染空白載體質(zhì)粒；同時(shí)選擇不進(jìn)行任何處理的HeLa細(xì)胞株作為空白對(duì)照組，只用含血清的DMEM培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)。

1.4 細(xì)胞增殖活性檢測(cè) 采用四甲基偶氮唑鹽法檢測(cè)細(xì)胞的增殖活性。3組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后制備出細(xì)胞懸液，按照每孔細(xì)胞數(shù)1×105個(gè)進(jìn)行接種，加入96孔板中培養(yǎng)。培養(yǎng)2 d后每孔加入四甲基偶氮唑鹽溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，添加二甲基亞砜，振蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解，用酶標(biāo)儀(美國(guó)Sigma公司，型號(hào)：2892型)檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)處的吸光度值(A)，計(jì)算細(xì)胞增殖活性，細(xì)胞增殖活性=[(實(shí)驗(yàn)組吸光度值-空白組吸光度值)/(對(duì)照組吸光度值-空白組吸光度值)]×100%。

1.5 細(xì)胞侵襲檢測(cè) 將基質(zhì)膠鋪于Transwell侵襲小室聚碳酯微孔膜的上表面，37℃放置30 min。各組取1×105個(gè)培養(yǎng)48 h后的細(xì)胞分別加入Transwell上室中，在下室中加入600 μL含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，甲醛固定微孔膜下層細(xì)胞并采用蘇木精-伊紅染色4 h，在400倍光學(xué)顯微鏡下任意選取5個(gè)視野，對(duì)每個(gè)視野中的微孔細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞侵襲穿透指數(shù)。細(xì)胞侵襲穿透指數(shù)=微孔侵襲穿透細(xì)胞數(shù)/微孔總細(xì)胞數(shù)。

1.6 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 將3組培養(yǎng)48 h的細(xì)胞接種于6孔板中，每孔15×104個(gè)細(xì)胞，低溫離心收集細(xì)胞，使用磷酸緩沖鹽溶液洗滌兩遍，添加300 μL結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞；添加5 μL的膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素混勻，在室溫下避光孵育15 min；上機(jī)前5 min再加入5 μL碘化丙啶染色，上機(jī)即刻再加200 μL結(jié)合緩沖液，置于流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司，型號(hào)：8714型)分析。每個(gè)樣品隨機(jī)計(jì)數(shù)4個(gè)視野，計(jì)算凋亡指數(shù)。凋亡指數(shù)=凋亡細(xì)胞數(shù)/(凋亡細(xì)胞數(shù)+正常細(xì)胞數(shù))×100%。

1.7 蛋白表達(dá)檢測(cè) 將3組培養(yǎng)48 h的細(xì)胞5 mL，3 000 r/min離心10 min，取下層細(xì)胞，裂解細(xì)胞后12 000 r/min離心，取上清，沸水浴變性5 min，取50 μg蛋白上樣，通過(guò)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳實(shí)現(xiàn)分離，對(duì)蛋白進(jìn)行點(diǎn)轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，一抗(抗Caspase-3抗體、抗FAK抗體，1 ∶1 000) 4℃培養(yǎng)過(guò)夜，TBST緩沖液洗膜，二抗(1 ∶10 000)室溫培養(yǎng)1 h，TBST緩沖液洗膜，采用增強(qiáng)型電化學(xué)發(fā)光試劑盒(美國(guó)BD公司，批號(hào)：7244)進(jìn)行曝光處理。以β-肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)參檢測(cè)Caspase-3蛋白及FAK蛋白相對(duì)表達(dá)量。上述實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，取平均值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.00軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 3組的細(xì)胞增殖活性、凋亡指數(shù)、侵襲穿透指數(shù)和遷移指數(shù)比較 觀察組的細(xì)胞增殖活性、侵襲穿透指數(shù)和遷移指數(shù)均低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組(均P<0.05)，凋亡指數(shù)大于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組(P<0.05)，但空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組的上述指標(biāo)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 3組的細(xì)胞增殖活性、凋亡指數(shù)、侵襲穿透指數(shù)和遷移指數(shù)比較(x±s,%)

注：與空白對(duì)照組比較，#P<0.05；與陰性對(duì)照組比較，*P<0.05。

2.2 3組細(xì)胞Caspase-3與FAK蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 觀察組的Caspase-3相對(duì)表達(dá)量高于陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組，F(xiàn)AK蛋白相對(duì)表達(dá)量低于陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組。見(jiàn)圖1。

圖1 3組的Caspase-3與FAK蛋白相對(duì)表達(dá)情況

3 討 論

我國(guó)宮頸癌的發(fā)病人數(shù)逐年上升，且呈年輕化趨勢(shì)。目前宮頸癌的治療主要采用手術(shù)與放療為主，化療為輔的綜合治療，但都存在一定的缺陷，且不良反應(yīng)較多[13]。研究表明，腫瘤的發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲平衡有關(guān)，細(xì)胞過(guò)度增殖與侵襲、凋亡受抑制均是影響腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素[14]。

FAK主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，是一個(gè)分子量為125 kD的非受體、非膜性的胞質(zhì)酪氨酸蛋白激酶[15]，其在進(jìn)化上高度保守，并在調(diào)節(jié)細(xì)胞生存、黏附、凋亡中發(fā)揮重要作用。RNA干擾作為一種新興的逆向遺傳研究方法，具有無(wú)毒副作用、高效、高特異性等特點(diǎn)[16]。本研究構(gòu)建了針對(duì)FAK基因的siRNA表達(dá)載體pSuper-FAK，并成功篩選出穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株來(lái)觀察FAK蛋白表達(dá)量的變化，結(jié)果顯示，觀察組的Caspase-3相對(duì)表達(dá)量高于陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組，F(xiàn)AK蛋白相對(duì)表達(dá)量低于陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組，提示pSuper-FAK導(dǎo)入后能降低宮頸癌細(xì)胞FAK蛋白的表達(dá)。本研究顯示，觀察組的細(xì)胞增殖活性低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組(P<0.05)，但空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示FAK具有調(diào)節(jié)宮頸癌細(xì)胞增殖的作用，F(xiàn)AK基因表達(dá)下調(diào)后，細(xì)胞增殖能力下降，考慮其增殖能力下調(diào)可能為細(xì)胞周期改變而引起。有研究顯示肺癌細(xì)胞中的FAK活化可促進(jìn)細(xì)胞分裂，下調(diào)FAK表達(dá)則抑制細(xì)胞增殖[17]，與本研究結(jié)果相似。

FAK在乳腺癌、舌癌、甲狀腺癌、前列腺癌、宮頸癌、直腸癌等多種上皮及間質(zhì)來(lái)源的腫瘤中高表達(dá)或過(guò)度激活[18]。失巢凋亡是指正常的上皮和內(nèi)皮細(xì)胞從細(xì)胞外基質(zhì)上脫離時(shí)發(fā)生的凋亡模式，整合素和FAK調(diào)控腫瘤細(xì)胞的失巢凋亡。FAK還能刺激內(nèi)源性的Caspase而強(qiáng)有力地阻斷細(xì)胞凋亡[19]。有研究表明，宮頸癌標(biāo)本中FAK表達(dá)陽(yáng)性率高，而宮頸細(xì)胞、宮頸炎細(xì)胞中FAK表達(dá)為陰性，F(xiàn)AK高表達(dá)與宮頸癌患者臨床預(yù)后不良相關(guān)，特別是FAK基因可通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞凋亡而起到促腫瘤的作用，通過(guò)下調(diào)FAK基因表達(dá)，可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[20]。本研究結(jié)果顯示，觀察組的細(xì)胞凋亡指數(shù)高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組(P<0.05)，表明抑制FAK的表達(dá)能促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞凋亡。

宮頸癌是一種以腫瘤細(xì)胞的持續(xù)增生與侵襲、永不凋亡為特征的惡性腫瘤，而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲及抑制凋亡的細(xì)胞機(jī)制是目前研究的重點(diǎn)。腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移是指從腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)部位與基底膜黏附，侵入周圍組織、進(jìn)入血液與淋巴循環(huán)、從循環(huán)系統(tǒng)中遷出等的過(guò)程[21]。具有侵襲能力的癌細(xì)胞在侵襲過(guò)程中分泌降解酶降解周圍組織，可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散與轉(zhuǎn)移。FAK作為整合素信號(hào)中的重要節(jié)點(diǎn)，其高表達(dá)可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移能力[22]。相關(guān)研究結(jié)果顯示，F(xiàn)AK在低侵襲性宮頸癌細(xì)胞株中的表達(dá)較低，而在高侵襲性宮頸癌細(xì)胞株中的表達(dá)較高[23]。本研究結(jié)果顯示，觀察組的細(xì)胞侵襲穿透指數(shù)和細(xì)胞遷移指數(shù)均低于空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組(均P<0.05)，與上述研究結(jié)果相似。

總之，RNA干擾FAK基因表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖、侵襲及遷移能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡和Caspase-3蛋白的表達(dá)，從而發(fā)揮抑癌作用。