李慧婷 趙杰 李海泉 施萍 張衍民 杜永亮

徐州醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院呼吸內科,徐州221006

支氣管哮喘(哮喘)患者氣道平滑肌細胞(airway smooth muscle cell,ASMC)呈現病理狀態(tài),表現為高增殖性、高收縮性及高分泌性[1],是參與哮喘發(fā)病的重要細胞。其高分泌性表現為在炎癥因子作用下分泌大量炎癥因子[如IL-6、IL-8、IL-13及嗜酸粒細胞趨化因子(Eotaxin)]及細胞外基質蛋白等[2],這些炎癥介質可導致氣道炎癥持續(xù)及級聯放大,反過來作用于ASMC,致其增殖增加及收縮增強,參與哮喘發(fā)病。我們前期研究發(fā)現莫西沙星可抑制大鼠ASMC 炎癥因子IL-8 及Eotaxin的分泌[3],但具體機制尚不清楚。小凹蛋白-1(caveolin-1,Cav-1)在氣道炎癥中擔當著重要角色[4],且哮喘患者Cav-1水平明顯下調[5],提示Cav-1對氣道炎癥具有保護作用。本研究旨在探討莫西沙星對ASMC的Cav-1蛋白及mRNA 表達的影響,探索莫西沙星對ASMC 抗炎作用發(fā)揮的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料 莫西沙星(德國拜耳醫(yī)藥保健股份公司),Cav-1 人抗山羊單克隆抗體(16447-1-AP,美國proteintech公司),二抗山羊抗兔IgG H & L(HRP)(ab6721,英國abcam 公司),胎牛血清(中國上海徠創(chuàng)生物科技有限公司),大鼠[中國,徐州醫(yī)科大學動物房,動物許可證號：SYXK(蘇)2016-0028],熒光定量檢測試劑盒(RR420A,中國上海馳勇生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物飼養(yǎng)及分組 用隨機數字表法將40只SD 雄性大鼠隨機分為正常組(10 只),哮喘組(30只),適應性飼養(yǎng)一周。

1.2.2 哮喘大鼠模型制備 將30只哮喘組大鼠應用雞卵蛋白腹腔注射(1 mg)及間斷霧化吸入3次(30 min)的方式復制哮喘大鼠模型,正常組大鼠應用同等量生理鹽水干預,方法同前[6]。

1.2.3 ASMC 的培養(yǎng)及傳代 無菌摘取正常組及哮喘組大鼠氣管,貼壁法進行細胞原代培養(yǎng),以胰酶消化法進行ASMC 傳代并自然純化細胞,實驗取5～6代細胞,方法同前[7]。

1.2.4 Western blot檢測Cav-1蛋白表達 將培養(yǎng)細胞分為正常組作為空白對照組(A 組),哮喘組分為哮喘對照組(B 組)、莫西沙星干預哮喘組(C組)、地塞米松干預哮喘組(D 組)。A 組用正常血清培養(yǎng)細胞,B、C、D 組用致敏血清培養(yǎng),方法同前[3]。A、B 組用生理鹽水處理細胞,C 組應用莫西沙星(5 mg/L)處理細胞,D 組應用地塞米松處理細胞,培養(yǎng)ASMC 48 h,提取細胞總蛋白,經電泳、轉膜后雜交,一抗為Cav-1人抗山羊單克隆抗體,二抗為山羊抗兔IgG,以NBT/BCIP顯色。條帶灰度用Image J軟件分析。實驗重復操作3次。

1.2.5 qRT-PCR 定量檢 測 Cav-1 m RNA 表達

1.2.5.1 細胞RNA 提取 前期處理細胞方法同上(1.2.3),干預ASMC 48 h后,在細胞液中加入TRIzol試劑,提取細胞RNA。檢測RNA 純度,結果顯示OD260/280 比值在1.8～2.0之間,表明無RNA 降解,無蛋白污染。

1.2.5.2 cDNA 的合成 取總RNA 提取物加入隨機引物、緩沖液、逆轉錄酶等,混勻后在42 ℃溫浴2 h,94 ℃,5～10 min,待逆轉錄反應完成之后,將cDNA 保持在-20 ℃冰箱備用。

1.2.5.3 qRT-PCR 反應 目的基因及內參基因的引物設計,先從中查找相應基因的序列,在引物設計軟件中設計相應引物,引物序列如下：Caveolin-1,上游5'-GCGACCCTAAACACCTCAAC-3',下游5'-ATGCCGTCAAAACTGTGTGTC-3'；β-actin,上 游 5'-TTGTTACAGGAAGTCCCTTGCC-3',下 游 5'-ATGCTATCACCTCCCCTGTGTG-3'；Cav-1擴增片段為138 bp,β-actin擴增101 bp。將PCR 反應體系置于離心機以4 ℃、5 500 r/min,離心半徑6 cm,離心5 min,上機,循環(huán)程序：95 ℃,2min；95 ℃,15 s；60 ℃,50 s；40 個循環(huán)。

1.2.5.4 數據的分析 首先將實驗所有的基因Ct值整理好,之后每一組樣本自身的目的基因Ct值減去自身內參基因Ct值,得到的數就是△Ct。換成公式就是：△Ct=Ct(目的基因)-Ct(內參基因)。用本次實驗研究樣本的△Ct減去對照組樣本的△Ct 并同時對結果取相反數,結果就是-△△Ct。最后,對-△△Ct進行2 的冪運算,即2-△△Ct就得出實驗組和對照組靶基因的轉錄倍數。

1.3 統計學分析 采用SPSS 20.0軟件包統計分析數據。所有實驗數據使用。2組數據之間的比較使用Student-t檢驗,多組間采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 ASMC 形態(tài)鑒定 倒置顯微鏡下,培養(yǎng)的ASMC呈梭形,平行生長,束狀排列,密集與稀疏處相互交錯呈 “峰谷狀”(圖1)。

圖1 倒置顯微鏡下的細胞形態(tài)學鑒定圖 ×400

2.2 ASMC 免疫組織化學法鑒定 免疫細胞化學檢測法表明,抗平滑肌-actin抗體呈陽性染色即胞漿內可見大量綠色熒光,證實所培養(yǎng)細胞是ASMC(圖2)。

圖2 免疫熒光顯微鏡法示AMSC細胞發(fā)綠色熒光 ×400

2.3 莫西沙星對ASMC Cav-1蛋白表達的影響B(tài)組[(1.16±0.05)]Cav-1蛋白表達量均較A、C、D 組[Cav-1 蛋白表達量分別為(3.56±0.05)、(2.86±0.11)、(3.01±0.17)]降低,差異有統計學意義(P值均＜0.05)。C組與D 組之間Cav-1 蛋白表達量差異無統計學意義(P＞0.05)。見圖3、4。

圖3 Western blot檢測ASMC Cav-1蛋白電泳圖

圖4 莫西沙星對ASMC Cav-1蛋白表達的影響

2.4 莫西沙星對ASMC Cav-1 m RNA 表達的影響 qRT-PCR結果顯示B 組[(1.00±0.11)]Cav-1 mRNA 表達量均較 A、C、D 組[m RNA 表達量分別為(3.26±0.22)、(2.68±0.11)、(2.93±0.05)]降低,差異有統計學意義(P值均＜0.05),C 組與D 組之間Cav-1蛋白表達量差異無統計學意義(P＞0.05)。見圖5。

3 討論

哮喘患者ASMC 呈現病理狀態(tài)[1],在哮喘發(fā)病中充當著促炎細胞及主要的炎癥效應細胞雙重角色[8],其量的增加是哮喘患者大氣道進行性狹窄的主要原因[9],與重癥及難治性哮喘發(fā)病密切相關[10]。因此,尋找針對ASMC 發(fā)揮抗炎免疫調節(jié)作用的藥物及作用機制可能將為重癥及難治性哮喘的控制及治療提供新的思路。

圖5 莫西沙星對ASMC Cav-1 mRNA 表達的影響

我們已證實莫西沙星可以直接作用于大鼠ASMC,干擾ASMC 增殖[11]、誘導凋亡[7]及抑制炎癥因子分泌[3],本實驗中莫西沙星可以直接干預大鼠ASMC并影響ASMC形態(tài)及數量,這與我們既往結論一致。

莫西沙星可對多種細胞發(fā)揮抗炎調節(jié)作用[3,12],但其具體作用機制尚不清楚。Cav-1作為支架蛋白構成細胞表面穴樣內陷(Caveolae)介導胞吞,其可通過抑制一氧化氮生成[13]及影響ASMC內鈣離子濃度在氣道炎癥中發(fā)揮重要作用[14],但莫西沙星對哮喘氣道炎癥的保護作用是否與Cav-1相關少有研究。

本實驗研究發(fā)現大鼠ASMC 中存在Cav-1 蛋白及 m RNA 表達。哮喘組 ASMC Cav-1 蛋白及m RNA 表達量均較正常組明顯降低,提示Cav-1可能在哮喘性氣道炎癥中擔當保護作用,與既往結論一致[14]。應用莫西沙星或地塞米松干預哮喘組ASMC 后,結果顯示 2 組 ASMC Cav-1 蛋 白及m RNA 表達量均較哮喘對照組明顯增加,且2組之間差異無統計學意義,提示莫西沙星可增加哮喘大鼠ASMC Cav-1蛋白及m RNA 表達量,但其是否為莫西沙星抑制哮喘性大鼠ASMC 炎癥因子IL-8及Eotaxin 分泌的上游機制,尚需進一步研究。另外,關于莫西沙星增加哮喘大鼠ASMC Cav-1蛋白及m RNA 表達量的具體機制仍未可知。

莫西沙星組織滲透性較強,肺組織細胞內濃度較血清中高達數倍甚至數十倍,與靜脈給藥相比,霧化吸入后氣道上皮細胞內濃度并未明顯升高[15],主要因為細胞存在藥物外排機制。P糖蛋白是介導藥物主動外排的主要轉運蛋白,對脂質藥物最為敏感[16],莫西沙星脂溶性較強,當胞內濃度較高時,可上調P 糖蛋白,啟動外排機制,防止胞內藥物濃度過高[15]。P 糖蛋白轉運功能的發(fā)揮需要借助細胞表面Cav-1 支架蛋白的作用[17]。另外,近年來研究發(fā)現過表達Cav-1可明顯提高食管鱗狀細胞癌P糖蛋白m RNA 及蛋白水平,敲減Cav-1將致P糖蛋白表達明顯下降,提示Cav-1對P糖蛋白表達具有調控作用[18]。我們推測當莫西沙星以高濃度擴散進入ASMC 胞內時,P 糖蛋白首先感知刺激信號,然后引起Cav-1表達水平上調,Cav-1表達上調后反過來刺激P 糖蛋白表達增加,最后P糖蛋白將胞內濃度過高的莫西沙星轉運出細胞,但具體機制尚需更多的研究。

本研究結果揭示莫西沙星可增加哮喘大鼠ASMC Cav-1的表達,其可能與莫西沙星抑制哮喘大鼠氣道炎癥機制相關。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突