沈國蔚，成心錕，顏世昌，張俊，丁惠民

（南京醫(yī)科大學(xué)附屬明基醫(yī)院骨科，江蘇 南京 210019）

囊性纖維化（Cystic fibrosis，CF）是一種常見的常染色體隱性遺傳病，是由于囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子（Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR）編碼的基因突變引起的嚴(yán)重疾病，近年來亞洲發(fā)病率約1/10萬，呈上升趨勢[1，2]。CFTR是一種cAMP依賴的氯離子通道蛋白，廣泛表達于各組織的上皮細胞，介導(dǎo)離子和水分在上皮細胞的分泌和轉(zhuǎn)運。CFTR功能異常是引起CF患者多系統(tǒng)病變的主要原因，主要臨床癥狀為CFTR功能異常所致脂類及其它營養(yǎng)素的吸收障礙、胰腺衰竭以及慢性感染或者細菌引起的二重感染導(dǎo)致的嚴(yán)重肺部功能障礙[3，4]，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量。近年來研究表明，CFTR參與上皮細胞的凋亡過程[5]。然而CFTR和骨細胞凋亡的關(guān)聯(lián)研究尚未有報道，而本研究主要目的是探討CFTR在破骨細胞中的表達，以及CFTR對破骨細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

人支氣管細胞系16HBE14，人破骨細胞購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫，胎牛血清及雙抗（青霉素、鏈霉素）購自美國Gibco公司，DMEM細胞培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司，PVDF膜購自美國 Sigma公司，Lip2000、SYBR Premix Ex TaqTM II試劑盒購自日本TaKaRa公司，Annexin-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自凱基生物，CTFR、自殺相關(guān)因子（Factor associated suicide，F(xiàn)as）、Fas 配體（Fas ligand，F(xiàn)asL）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde -3 -phosphate dehydrogenase，GAPDH），二抗購自美國Cell Sigaling Technology公司。主要儀器：細胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司，F(xiàn)ACSCanto流式細胞儀購自美國BD公司，Elx800型自動酶標(biāo)儀購自美國BioTek公司，7300型定量PCR儀購自美國ABI公司，Mini PROTEAN 3小型垂直式電泳儀購自美國Bio Rad公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素及100 g/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)人支氣管細胞系16HBE14和破骨細胞，于37℃、5%CO2恒溫密閉細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2-3天換液1次，待融合70%-80%時，用胰蛋白酶消化傳代進行后續(xù)實驗。

1.2.2 RNA提取和real-time RT-PCR

TRIzol法提取細胞的總RNA按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以cDNA為模板進行RT-PCR，檢測CFTR mRNA表達水平。Real-time RT-PCR按照Roche FastStart Universal SYBR Green Master（ROX）說明書進行，相對基因表達采用2-ΔΔCT 法計算[7]。

1.2.2 蛋白質(zhì)印跡檢測（Western Blot）

細胞經(jīng)RIPA裂解液裂解提取蛋白，運用BCA蛋白檢測法對蛋白進行定量檢測，經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)PVDF膜，室溫5%脫脂牛奶封閉1 h。然后加入一抗4℃孵育過夜，再加入HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h。采用化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)檢測，Adobe Photoshop CS4軟件對條帶進行灰度掃描檢測。目的蛋白的灰度值除以內(nèi)參的灰度值以校正誤差，所得結(jié)果代表目的蛋白相對表達量。

1.2.3 流式細胞術(shù)

將人支氣管細胞系16HBE14和破骨細胞細胞接種6孔培養(yǎng)板中，1×106/孔，待轉(zhuǎn)染后，PBS沖洗后，加入Annexin V-FITC和PI，15 min后采用流式細胞儀檢測各組的細胞凋亡率。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 20.0進行統(tǒng)計學(xué)分析。兩組之間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（one-way-ANOVA）進行比較，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CFTR在破骨細胞中的表達

利用Real time PCR和Western Blot的方法，研究體外培養(yǎng)的人破骨細胞中CFTR的表達，并以人支氣管細胞系16HBE14為陽性參照。結(jié)果顯示（圖1a和1b），人破骨細胞無論是mRNA水平還是蛋白水平均有表達，但是較人支氣管細胞系16HBE14B的表達水平較低。

圖1 CFTR在破骨細胞中的表達

2.2 CFTR對破骨細胞凋亡的影響和機制

2.2.1 構(gòu)建CFTR超表達載體

運用基因工程手段[8]構(gòu)建含有GFP的CFTR超表達載體，通過病毒感染的方法導(dǎo)入體外培養(yǎng)的人破骨細胞中，從基因水平上調(diào)CFTR的表達，Western Blot驗證CFTR蛋白表達上調(diào)，證明載體轉(zhuǎn)染成功（圖2）。

圖2 構(gòu)建CFTR超表達載體

2.2.2 超表達CFTR對破骨細胞凋亡的影響

應(yīng)用流式細胞儀檢測CFTR超表達后對破骨細胞凋亡率的影響，圖3結(jié)果顯示，SiRNA轉(zhuǎn)染組的凋亡率較對照組和空白轉(zhuǎn)染組顯著提高。結(jié)果證明，轉(zhuǎn)染后超表達CFTR，會促進破骨細胞的凋亡。

2.2.3 超表達CFTR對破骨細胞中Fas/FasL表達的影響

利用Real-time PCR和Western Blot法檢測體外培養(yǎng)破骨細胞Fas/FasL的表達，結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染組凋亡相關(guān)蛋白Fas及FasL的表達，無論是mRNA水平還是蛋白水平，均較對照組及空白轉(zhuǎn)染組升高更為明顯。說明轉(zhuǎn)染后，CFTR高表達，通過促進凋亡相關(guān)蛋白Fas及FasL的表達，進而促進破骨細胞的凋亡，見圖4。

圖3 超表達CFTR對破骨細胞凋亡的影響

圖4 超表達CFTR對破骨細胞Fas/FasL表達的影響

3 討論

CF是一種常見的常染色體隱性遺傳病，是由于CFTR編碼基因突變引起的嚴(yán)重疾病，發(fā)病率約1/10萬[1,2]。CFTR是一種cAMP依賴的氯離子通道蛋白，廣泛表達于各組織的上皮細胞，介導(dǎo)離子和水分在上皮細胞的分泌和轉(zhuǎn)運。CFTR功能異常是引起CF患者多系統(tǒng)病變的主要原因，主要臨床癥狀為CFTR功能異常所致脂類及其它營養(yǎng)素的吸收障礙、胰腺衰竭以及慢性感染或者細菌引起二重感染所致嚴(yán)重的肺部功能障礙[3,4]，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量。近年來研究表明，CFTR參與上皮細胞的凋亡過程。在呼吸系統(tǒng)中，Durieu等[5]發(fā)現(xiàn)CFTR可以通過Fas和FasL促進氣道上皮細胞凋亡；在消化系統(tǒng)中，Rottner等[6]研究發(fā)現(xiàn)CFTR異常表達會導(dǎo)致胰腺細胞過度氧化應(yīng)激引起凋亡增高；而在生殖系統(tǒng)中，研究發(fā)現(xiàn)CFTR在性激素刺激下高表達可能引起子宮內(nèi)膜細胞凋亡的增加，進而影響子宮內(nèi)膜容受性[7]。

然而，CFTR和骨細胞凋亡的關(guān)聯(lián)性尚有待深入研究。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，CFTR蛋白在人骨組織成骨細胞和破骨細胞中均有表達，主要定位在成骨細胞和破骨細胞的細胞漿中[8]。Bronckers等[9]在人和小鼠的成釉質(zhì)細胞、成牙質(zhì)細胞以及骨細胞中，也發(fā)現(xiàn)了CFTR的表達。這些結(jié)果提示，CFTR在骨質(zhì)維持中發(fā)揮一定的作用。最近，有研究對CFTR在骨代謝中的作用展開了進一步研究，發(fā)現(xiàn)在體外培養(yǎng)的成骨細胞中，CFTR蛋白特異性抑制后會下調(diào)OPG并上調(diào)PGE2的表達，提示CFTR可能直接在骨組織中發(fā)揮作用，影響骨形成和骨吸收的穩(wěn)態(tài)[10,11]。因此，對骨組織中CFTR蛋白在維持骨代謝功能的深入研究，對于闡明CF骨病的發(fā)生具有重要意義。本研究利用Real time PCR和Western Blot的方法，研究體外培養(yǎng)的人破骨細胞中CFTR的表達，并以人支氣管細胞系16HBE14為陽性參照。結(jié)果顯示，CFTR在人破骨細胞低表達，進而利用轉(zhuǎn)染技術(shù)，使破骨細胞高表達CFTR，且高表達CFTR促進了破骨細胞的凋亡。

研究表明，F(xiàn)as/FasL途徑在細胞凋亡過程中起著十分重要的作用。它是TNF家族成員中，凋亡機制涉及范圍最廣泛的一條死亡相關(guān)受體通路。Fas是屬于TNF受體（TNFR）家族的一種膜受體，其配體FasL（CD95L）屬于TNF家族[12]。我們利用Real-time PCR和Western Blot法檢測過表達CFTR后破骨細胞中Fas/FasL的表達，結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染組凋亡相關(guān)蛋白Fas及FasL的表達，無論是mRNA水平還是蛋白水平，較對照組及空白轉(zhuǎn)染組，均表達升高。總之，本研究初步發(fā)現(xiàn)CFTR通過促進Fas/FasL的高表達，進而促進破骨細胞凋亡。