張 騰，尹夢(mèng)嬌，郭紅媛，姜曉東，賈舉慶，王艷勝，溫 賀，梁月秀，趙立松，趙威軍，呂晉慧，李艷鋒，張春來(lái)，

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，國(guó)家功能雜糧技術(shù)創(chuàng)新中心，山西省旱作栽培與作物生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西省黃土高原特色作物高效生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心，山西太谷030801；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高粱研究所，山西晉中030600；3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，山西太谷030801）

高粱（Sorghum bicolor）是世界上第五大禾谷類作物，大多數(shù)品種具有抗旱、耐貧瘠和耐鹽堿等多重抗性[1-2]。其是我國(guó)非常重要的旱地糧食作物，在多個(gè)省份均有種植，且栽培面積較廣，其中以東北地區(qū)為最多。部分高粱基因組的測(cè)序工作已經(jīng)在2009 年前后順利完成，如高粱品種BTx623，這使得從基因組水平來(lái)揭示高粱重要基因家族的功能成為現(xiàn)實(shí)與可能[2-3]。

Dicer-like（DCL）基因在植物體內(nèi)表達(dá)的蛋白最終產(chǎn)物是一種核糖核酸內(nèi)切酶，該基因群是RNase III 家族中能夠特異識(shí)別雙鏈RNA 的一類基因[4]。由于DCL 基因的功能涉及到了多種起調(diào)控作用的小RNA 分子的產(chǎn)生，所以DCL 基因?qū)Υ蠖鄶?shù)植物的生長(zhǎng)發(fā)育、抗性效應(yīng)和非生物脅迫等響應(yīng)過(guò)程起到了非常重要的作用[5]。

目前，DCL 基因在擬南芥（Arabidopsis thaliana）上研究比較透徹，擬南芥共有4 個(gè)DCL：AtDCL1，AtDCL2，AtDCL3 和AtDCL4。其中，AtDCL1 的primiRNA 被剪切2 次產(chǎn)生21 nt 雙鏈miRNA，并從核內(nèi)釋放，分別與雙鏈RNA 結(jié)合蛋白HYL1 和鋅蛋白SERRATE（SE）結(jié)合[6-8]；當(dāng)植物被感染時(shí)，AtDCL2負(fù)責(zé)22 nt 病毒衍生的siRNA[9]；AtDCL3 產(chǎn)生24 nt ra-siRNA；AtDCL4 產(chǎn) 生21 nt ta-siRNA 和 一 些miRNA[10-12]。miRNA 和siRNA 的產(chǎn)生還需要ssRNA結(jié)合蛋白DAWDLE 和TOUGH[13-14]。

許多植物體DCL 基因的功能研究主要集中于siRNA 的產(chǎn)生及其功能方面，而在miRNA 的產(chǎn)生及功能研究卻相對(duì)較少[15]，比如植物無(wú)融合生殖與miRNA 以及基因沉默的關(guān)系如何，所以DCL 基因的功能及作用機(jī)制研究還有很大的空間。

本研究對(duì)高粱DCL（SbDCLs）基因結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)理化性質(zhì)與亞細(xì)胞定位、蛋白質(zhì)二三級(jí)結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進(jìn)化與基因差異表達(dá)進(jìn)行了分析，旨在為SbDCLs基因調(diào)控提供一定的試驗(yàn)依據(jù)與理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 植物組織取樣、RNA 提取和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

供試高粱品系為2457B，R111，1383-2，5-27sugarB和SSA-1。葉、根、莖取自生長(zhǎng)中期材料，胚珠、花藥取自抽穗但未散粉的穗子。幼嫩種子分別取自授粉后10，30 d 種子。用Trizol 試劑提取高質(zhì)量RNA，采用Hiseq4000 平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，各樣品產(chǎn)生Clean Data（去除污染、載體后序列）6～9 Gb，能完好地覆蓋高粱轉(zhuǎn)錄組。

1.2 生物信息學(xué)分析

1.2.1 基因檢索 以擬南芥（Arabidopsis thaliana）和水稻（Oryza sativa）的DCL 蛋白質(zhì)序列作為參考，將轉(zhuǎn)錄組測(cè)序檢測(cè)到SbDCLs 序列，在Phytozome（https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）和NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast搜尋和比對(duì)，最終確定轉(zhuǎn)錄組測(cè)序檢測(cè)到的DCL，并獲得SbDCLs 家族的基因序列、CDS 序列、蛋白序列；玉米（Zea mays）、谷子（Setaria italica）、大豆（Glycine max）、藜麥（Chenopodium quinoa Willd）的DCL 蛋白質(zhì)序列來(lái)自Phytozome 數(shù)據(jù)庫(kù)；甜菜（Beta vulgaris）和小麥（Triticum aestivum）的DCL 蛋白質(zhì)序列來(lái)自NCBI。

1.2.2 生物信息學(xué)分析方法 采用Gene Structure Display Sever（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）分 析 基 因的結(jié)構(gòu)；采用ExPASY-ProtParam tool（https：//web.expasy.org/protparam/）對(duì)蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)進(jìn)行分析；采用SignalP 4.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)是否含有信號(hào)肽；采用MultiLoc（https：//abi-services.informatik.uni-tuebingen.de/multiloc2/webloc.cgi）對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。

采用SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)；在Pfam（http：//pfam.xfam.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)SbDCLs 蛋白的功能結(jié)構(gòu)域；采用Raptor X（http：//raptorx.uchicago.edu/）對(duì)蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，采用Ramachandran Plot Analysis（http：//mordred.bioc.cam.ac.uk/）檢驗(yàn)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。

利用MEGA7 軟件，對(duì)序列進(jìn)行Clustal W 比對(duì)，然后再使用NJ 鄰接法（Neighbor Joining）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。利用已發(fā)表的高粱表達(dá)Atalas 數(shù)據(jù)[16-17]，獲取目的基因在高粱各個(gè)生育期不同部位的FPKM值，再利用HemI 軟件作出表達(dá)量的熱圖。利用MEGA7 軟件對(duì)CDS 序列進(jìn)行比對(duì)，再利用DnaSP v5軟件計(jì)算出編碼基因的進(jìn)化選擇壓力。

2 結(jié)果與分析

2.1 SbDCLs 基因家族基本信息

查找高粱的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，并利用數(shù)據(jù)庫(kù)篩選到SbDCLs 基因6 個(gè)（表1）。SbDCLs 基因長(zhǎng)度為6 533～25 401 bp，分布在第SBI-01，SBI-03 和SBI-06 共3 條染色體上；其中，SbDCL2a，SbDCL2b，SbDCL3b 和SbDCL1 集中在SBI-01 上，而且SbDCL2a 和SbDCL2b 在SBI-01 上串聯(lián)重復(fù)排列。每個(gè)SbDCLs 基因都有1 個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄本，本研究選用的為初級(jí)轉(zhuǎn)錄本蛋白，具體蛋白質(zhì)的編號(hào)如表1所示。

表1 SbDCLs 家族基因信息

2.2 SbDCLs 基因結(jié)構(gòu)分析

SbDCLs 基因結(jié)構(gòu)分析顯示（圖1），所有SbDCL 均存在上下游非編碼區(qū)，但其長(zhǎng)度相對(duì)于基因長(zhǎng)度均較短；SbDCL2a 基因CDS 數(shù)量最少，為10個(gè)，其他5 個(gè)SbDCLs 基因的CDS 數(shù)量為19～26 個(gè)；SbDCL4 基因的內(nèi)含子較長(zhǎng)，由于外顯子與內(nèi)含子接頭區(qū)存在一段高度保守的一致序列，SbDCL4 相對(duì)于其他SbDCLs 存在更多的高度保守序列數(shù)量。

2.3 SbDCLs 蛋白理化性質(zhì)

由表2 可知，SbDCLs 蛋白氨基酸數(shù)目為787～1 929 個(gè)，分子量大小在87 491.22～215 272.04 u，平均分子量大小為171 154.23 u；理論等電點(diǎn)為6.17～6.84，所有高粱DCL 蛋白等電點(diǎn)均小于7；不穩(wěn)定性系數(shù)分析表明，SbDCL2a 蛋白的穩(wěn)定系數(shù)為36.38，為穩(wěn)定蛋白，其余DCL 蛋白均為不穩(wěn)定蛋白（不穩(wěn)定系數(shù)＞40）；親水疏水性分析表明，SbDCLs蛋白均為兩性蛋白[18]。

表2 SbDCLs 蛋白理化性質(zhì)

2.4 SbDCLs 蛋白質(zhì)信號(hào)肽及亞細(xì)胞定位分析

表3 SbDCLs 蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

SbDCsL 蛋白質(zhì)的信號(hào)肽預(yù)測(cè)最大，C，Y，S 值均偏低，均＜0.5，表明蛋白都不含信號(hào)肽，不是分泌型蛋白。蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示（表3），SbDCLs 蛋白均定位在細(xì)胞核上，可能性為61.76%～99.99%，可能性都比較高；SbDCL1 置信度值為0.98，說(shuō)明其可靠性非常高，但是其他SbDCLs 置信區(qū)間值都較低，并不可靠。

2.5 SbDCLs 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)及功能結(jié)構(gòu)域分析

SbDCLs 蛋白家族的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α- 螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成（二者在蛋白質(zhì)中所占氨基酸數(shù)量的比例大于70%），而延伸鏈（延伸鏈?zhǔn)铅? 折疊的組成結(jié)構(gòu)）、β- 轉(zhuǎn)角比例較低（表4）。由此可推測(cè)，α- 螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲是SbDCLs 蛋白的大量結(jié)構(gòu)元件，而延伸鏈和β- 轉(zhuǎn)角則散布于整個(gè)蛋白質(zhì)中。

表4 SbDCLs 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析 %

由圖2 可知，SbDCLs 蛋白均含有2 個(gè)RNase III 基本結(jié)構(gòu)域；除了SbDCL2a 之外，其他SbDCLs均含有Helicase C，Dicer dimer 和PAZ 保守結(jié)構(gòu)域；SbDCL2a，SbDCL1 和SbDCL4 含有dsrm 模體；Sb-DCL2b，SbDCL3b 和SbDCL3a 都含有DEAD helicase；SbDCL1 和SbDCL4 都 含 有ResIII 和DND1 DSRM結(jié)構(gòu)域。

2.6 SbDCLs 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)模型

采用Raptor X 軟件預(yù)測(cè)高粱DCL 蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)顯示（圖3），DCL 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α- 螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成，與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果一致。采用MPAGE 中的Ramachandran plot analysis 軟件評(píng)估建模模型，結(jié)果顯示（表5），氨基酸殘基所處的最佳區(qū)域比率為86.90%～88.20%，可接受區(qū)域比率為7.80%～9.20%，高粱DCL 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)建模的可信度均大于95.50%。

表5 SbDCLs 蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)模型評(píng)估 %

2.7 DCL 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

SbDCLs 蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖4-A）分析，Sb-DCL2a 與SbDCL2b，SbDCL3b 與SbDCL3a 為旁系同源序列。DCL 蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖4-B）分析可知，DCL 分為4 個(gè)分枝，分別是DCL1，DCL2，DCL3和 DCL4；SbDCL1 與 ZmDCL1/101，SbDCL2a 與ZmDCL2b，SbDCL2b 與ZmDCL2a/105，SbDCL3a 與ZmDCL3a/104，SbDCL3b 與ZmDCL3b/102，SbDCL4與ZmDCL4/103 互為直系同源基因，說(shuō)明高粱與玉米的DCL 基因在進(jìn)化上同源關(guān)系更近；進(jìn)化樹(shù)中的單子葉植物（高粱、水稻、谷子、玉米和小麥）與雙子葉植物（擬南芥、大豆、甜菜和藜麥）不能聚到同一分枝下，說(shuō)了DCL 基因在進(jìn)化過(guò)程中出現(xiàn)單雙子葉的分化。

2.8 SbDCLs 表達(dá)分析

在葉片、根、莖、不同生育時(shí)期的種子、花藥和胚珠轉(zhuǎn)錄組中，檢測(cè)到6 個(gè)SbDCLs 的轉(zhuǎn)錄活性（圖5），SbDCLs 表達(dá)水平分析發(fā)現(xiàn)，除了SbDCL3b 幾乎不表達(dá)外，其他SbDCLs 均有相對(duì)較高的表達(dá)水平；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，SbDCLs 在種子、花藥和胚珠等生殖器官或組織的表達(dá)水平普遍高于葉、根、莖和芽等營(yíng)養(yǎng)器官。

高粱R111 和SSA-1 不同時(shí)期的種子及SSA-1 花藥SbDCLs 表達(dá)水平分析結(jié)果顯示（圖5-A），SbDCL2a，SbDCL1 和SbDCL4 表達(dá)水平相對(duì)于SbDCL2b 更高，但是在胚珠和花粉中SbDCL2b和這些基因一樣有較高的表達(dá)水平；隨著種子的成熟，SbDCL2a，SbDCL2b 和SbDCL1 表達(dá)水平有上升的趨勢(shì)，但是SbDCL3a 和SbDCL4 表達(dá)水平卻隨著種子成熟出現(xiàn)下降的趨勢(shì)；SbDCL2a，SbDCL2b，Sb－DCL3b 和SbDCL1 在花粉中的表達(dá)水平明顯高于胚珠，而SbDCL3a 和SbDCL4 卻是在胚珠的表達(dá)水平明顯高于花粉。

高粱品種1383-2，2457B 和5-27sugerB 的葉片以及高粱5-27sugerB 的根、莖和高粱R111 莖、葉SbDCLs 表達(dá)分析結(jié)果表明（圖5-B），SbDCL2b和SbDCL4 在不同品種的高粱葉片表達(dá)水平有顯著差異，在1383-2 葉片中表達(dá)水平遠(yuǎn)高于高粱2457B，R111 和5-27sugerB；除了SbDCL3a 在高粱5-27sugerB 莖中表達(dá)水平低于高粱R111 莖外，其余SbDCLs 在高粱5-27sugerB 莖中表達(dá)水平遠(yuǎn)高于高粱R111 莖。

利用高粱表達(dá)Atalas 數(shù)據(jù)構(gòu)建高粱表達(dá)量熱圖（圖6），由圖6 可知，SbDCL2b，SbDCL3b 在整個(gè)高粱生育期幾乎不表達(dá)，而SbDCL4 在整個(gè)生育期都只有低水平表達(dá)；但是SbDCL2a，SbDCL1 和Sb－DCL3a 在生育期某個(gè)階段具有較高的表達(dá)水平。其中，SbDCL3a 和SbDCL1 在花蕾期的穗部表達(dá)水平較高；而SbDCL2a 在成熟期的莖中部節(jié)間、花期的莖中部節(jié)間、花期的旗葉1 節(jié)間和成熟期的旗葉1節(jié)間表達(dá)水平較高；SbDCL3a 花期的穗上部和花蕾期的花梗表達(dá)水平較高。表達(dá)水平由高到低依次為花蕾期的穗部、莖中部節(jié)間和花期的莖中部節(jié)間、花蕾期的花梗、花期的旗葉1 節(jié)間、成熟期的旗葉1節(jié)間、花期的穗上部。

2.9 SbDCLs 進(jìn)化選擇分析

遺傳學(xué)中常用非同義突變率（Ka）與同義突變率（Ks）的比值（Ka/Ks）來(lái)判斷是否有選擇壓力作用于這個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因：如果Ka/Ks 遠(yuǎn)大于1，則認(rèn)為有正選擇效應(yīng)；如果Ka/Ks=1，則認(rèn)為存在中性選擇；如果Ka/Ks 遠(yuǎn)小于1，則認(rèn)為有純化選擇作用。SbDCLs 編碼區(qū)基因的Ka/Ks 遠(yuǎn)小于1，說(shuō)明SbDCLs蛋白的編碼基因受純化選擇作用（表6）。

表6 SbDCLs 進(jìn)化選擇參數(shù)

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明，高粱全基因組范圍內(nèi)鑒定出SbDCLs 基因共有6 個(gè)，分布在第SBI-01，SBI-03和SBI-06 共3 條染色體上；其中，SbDCL2a，SbDCL2b，SbDCL3b 和SbDCL1 集中在SBI-01 上，而且SbDCL2a 和SbDCL2b 在SBI-01 上串聯(lián)重復(fù)排列。SbDCL2a 與SbDCL2b 進(jìn)化樹(shù)上雖然是同源序列，但是SbDCL2a 功能結(jié)構(gòu)域上只有2 個(gè)RNase III 結(jié)構(gòu)域和1 個(gè)dsrm 模體，相比SbDCL2b 簡(jiǎn)單許多，同時(shí)二者染色體位置上屬于串聯(lián)重復(fù)，基因結(jié)構(gòu)相似，推測(cè)SbDCL2a 很可能是由SbDCL2b 小范圍復(fù)制所致。

SbDCLs 蛋白質(zhì)主要是兩性蛋白，且理論等電點(diǎn)小于7；除SbDCL2a 蛋白之外，其他SbDCLs 蛋白質(zhì)均不穩(wěn)定；所有SbDCLs 蛋白不存在信號(hào)肽，不是分泌型蛋白，這與SbDCLs 蛋白亞細(xì)胞定位均在細(xì)胞核上的結(jié)果表現(xiàn)一致。SbDCLs 蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要是α- 螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲；RNase III 結(jié)構(gòu)域是DCL 基本功能結(jié)構(gòu)；DCL 蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，但模型可信度大于95.50%。

系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果表明，SbDCLs 分為4 個(gè)亞家族，分別是DCL1，DCL2，DCL3 和DCL4，高粱與玉米的DCL 蛋白質(zhì)在進(jìn)化上同源關(guān)系更近。SbDCL2a，SbDCL1 和SbDCL3a 是高度表達(dá)基因，而且在生殖器官或組織中相對(duì)于營(yíng)養(yǎng)器官具有更高的表達(dá)水平，說(shuō)明SbDCLs 基因?qū)Ω吡粻I(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和生殖發(fā)育具有調(diào)控作用。SbDCL2b 在高粱的整個(gè)生育期表達(dá)水平均較低，但是在胚珠和花粉中擁有較高的表達(dá)水平，這與OHNISHI 等[19]在水稻中OsDCL2 優(yōu)先在卵細(xì)胞中表達(dá)研究結(jié)論一致，說(shuō)明Sb－DCL2b 在生殖發(fā)育過(guò)程中可能起調(diào)控作用。

目前，高粱等植物體的DCL 基因功能的研究主要是集中在小干擾RNA 的產(chǎn)生及其功能方面，而在微小RNA（miRNA）的產(chǎn)生及其功能方面的研究相對(duì)較少，就目前的研究與分析結(jié)果可以推測(cè)，這可能是因?yàn)楦吡坏戎参镏形⑿NA 的靶基因的表型不夠明顯[20]。DCL 基因的表達(dá)主要是通過(guò)RNA干擾機(jī)制來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)高粱等植物的基因表達(dá)調(diào)控。通過(guò)目前的研究結(jié)果分析得知，DCL 基因具有將雙鏈RNA 切割成多個(gè)小干擾RNA 的功能，但是小干擾RNA 是通過(guò)什么途徑或方式來(lái)引起目的mRNA 的沉默，則還需進(jìn)一步研究；另外，DCL 基因表達(dá)過(guò)程中所涉及的相關(guān)酶和一些蛋白質(zhì)的確定也需要進(jìn)一步研究與分析。