孟騰，徐美林

(1天津醫(yī)科大學(xué)，天津 300070；2天津市胸科醫(yī)院)

肺癌是全球最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，從組織學(xué)上可分為小細(xì)胞肺癌(SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)，其中后者占全部肺癌患者數(shù)的80%以上。肺癌患者5年生存率不足20%，雖然手術(shù)、化療、放療和阻斷表皮生長(zhǎng)因子受體通路改善了NSCLC患者的預(yù)后，但晚期患者的生存率仍然很低[1,2]。早期診斷、早期治療和新靶向藥物的出現(xiàn)會(huì)大大提高NSCLC的存活率，因此研究NSCLC患者的潛在靶點(diǎn)對(duì)于提高生存時(shí)間和治療效果具有十分重要的意義，尋找新的肺癌診斷標(biāo)志物成為當(dāng)今研究熱點(diǎn)。lncRNA是一類轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸(nts)的RNA分子，不編碼蛋白，參與多種生物的過(guò)程，包括染色質(zhì)修飾、基因印跡、基因轉(zhuǎn)錄和選擇性剪接，其參與調(diào)控各種生物過(guò)程，如細(xì)胞增殖、分化、生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)、凋亡等[3～7]。近年來(lái)，lncRNA在腫瘤中的作用已經(jīng)越來(lái)越引起臨床的關(guān)注。本研究觀察NSCLC組織中l(wèi)ncRNA LCAL1表達(dá)變化，分析LCAL1表達(dá)與NSCLC患者臨床病理參數(shù)、預(yù)后的關(guān)系，并探討其意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2014年1月～2016年6月天津市胸科醫(yī)院收治的NSCLC患者55例，男33例，女22例；TNM分期1期29例，2～4期26例，腫瘤直徑≤3 cm 31例，>3 cm 24例；組織病理類型為腺癌31例，鱗癌24例；23例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。所選患者術(shù)前均未行局部或全身放療或化療，均有完整的臨床和病理組織學(xué)資料，至少由2位病理學(xué)專家進(jìn)行診斷。手術(shù)留取NSCLC組織及癌旁(距癌邊緣>5 cm)正常肺組織各55例份，所有組織樣本取下后立即液氮冷凍，隨后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存。本次研究獲得天津市胸科醫(yī)院倫理委員會(huì)認(rèn)可。

1.2 組織中LCAL1檢測(cè)方法 取50 mg凍存組織，磨成粉末狀，加TRIzol抽提RNA。按照說(shuō)明書(shū)操作。組織中抽提RNA后，使用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其純度及濃度，取吸光度(A260/280)為1.8～2.0的RNA樣本，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將RNA樣本逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)條件：30 ℃、10 min，95 ℃、5 min。采用VIIA7 DX實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀分析，按照SYBR Green說(shuō)明書(shū)配制反應(yīng)總體系20 μL：2×SYRR Green 10 μL，ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μL，cDNA模板2 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL，RNase free ddH2O 6 μL。反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸34 s，共40個(gè)循環(huán)。PCR結(jié)束后，分析各孔的CT值(每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))，用2-ΔCt和2-ΔΔCt分析LCAL1的相對(duì)表達(dá)量和表達(dá)倍數(shù)[8]。計(jì)算出標(biāo)化后的2-ΔCt(其值越大，起始拷貝數(shù)越多)，ΔCt=樣本Ct均值-內(nèi)參Ct均值，設(shè)對(duì)照組目的基因的量為1，則實(shí)驗(yàn)組目的基因的量為對(duì)照組目的基因的量的2-ΔΔCt倍，ΔΔCt=[(樣本Ct目的基因一樣本Ct內(nèi)參基因)-(對(duì)照組Ct目的基因-對(duì)照組Ct內(nèi)參基因)]，以2-ΔΔCt代表目的基因的相對(duì)表達(dá)量，設(shè)定2-ΔΔCt≥1為陽(yáng)性表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC及正常肺組織中LCAL1表達(dá)比較 NSCLC及正常肺組織LCAL1表達(dá)水平分別為0.15(0.08，0.22)、0.05(0.016，0.14)，兩者比較，P<0.05。

2.2 組織中LCAL1表達(dá)與NSCLC臨床病理參數(shù)的關(guān)系 LCAL1表達(dá)與NSCLC臨床病理參數(shù)的關(guān)系結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 LCAL1表達(dá)與NSCLC臨床病理參數(shù)的關(guān)系

注：由表1可知，LCAL1表達(dá)與NSCLC患者腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期有關(guān)(P均<0.05)。

2.3 組織中LCAL1表達(dá)與NSCLC患者預(yù)后的關(guān)系 按照LCAL1表達(dá)水平將NSCLC患者分為L(zhǎng)CAL1高表達(dá)者(34例)和LCAL1低表達(dá)者(21例)，兩者中位生存時(shí)間分別為30個(gè)月、48個(gè)月，兩者比較P<0.05。

3 討論

肺癌作為全球最為常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，近年來(lái)其發(fā)病率與病死率呈上升趨勢(shì)。女性肺癌發(fā)病率位于第4位，病死率位于第2位；男性其發(fā)病率占首位，同時(shí)也是導(dǎo)致男性惡性腫瘤死亡的重要原因[9,10]。肺癌最常見(jiàn)的病理類型是非小細(xì)胞肺癌，其預(yù)后相對(duì)于小細(xì)胞肺癌患者來(lái)說(shuō)較好。有關(guān)調(diào)查研究顯示，NSCLC患者早期如果能夠得到確診的話，可以通過(guò)手術(shù)，放療和化療等治療方法獲得較好的預(yù)后，但是即便如此，NSCLC的總體5年生存率仍然很低，不足20%[11～13]。由于肺癌起病隱匿，早期患者的臨床表現(xiàn)并不典型，病癥顯現(xiàn)初期，肺癌患者的癥狀通常為非特異性，例如咳嗽、氣短、咳血或肺炎。隨著病情的進(jìn)展，會(huì)出現(xiàn)陣發(fā)性刺激性嗆咳為特征的突發(fā)咳嗽，或長(zhǎng)期頻繁的咳嗽，出現(xiàn)咳嗽性質(zhì)的改變，但是一般不會(huì)咳出痰液或僅有少量白色泡沫樣痰咳出。此外，癥狀較輕且定位模糊的胸背痛、胸悶等癥狀也可能出現(xiàn)[14]。我國(guó)肺癌的診療技術(shù)已取得了很大的進(jìn)步，從傳統(tǒng)的單一手術(shù)切除治療發(fā)展到現(xiàn)在的切除、放療與化療三者組合式聯(lián)合治療，再到通過(guò)對(duì)肺癌生物學(xué)機(jī)制的深入研究，發(fā)現(xiàn)新的生物學(xué)標(biāo)記物和靶向治療的有效運(yùn)用。各種調(diào)控基因在肺癌發(fā)生中起到十分關(guān)鍵的作用，復(fù)雜的、多步驟的轉(zhuǎn)移過(guò)程是由特異的基因產(chǎn)物與基因突變決定的。故探討肺癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制具有重要意義。

人類基因組包含約51 382個(gè)lncRNA基因，20 000～25 000個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因和約2 500個(gè)miRNA。許多l(xiāng)ncRNAs表現(xiàn)出時(shí)空和組織特異性的表達(dá)模式，這表明lncRNAs的表達(dá)在組織發(fā)育和發(fā)病過(guò)程中都是程序化和高度調(diào)控的。在lncRNAs的核酸結(jié)構(gòu)中，存在著與其他RNA(如mRNA和miRNA)結(jié)合的固有能力，這些RNA與lncRNAs或不完全或完全互補(bǔ)。lncRNA通過(guò)直接與mRNA相互作用，在mRNA剪接、編輯、亞細(xì)胞分布和穩(wěn)定性調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用[15]。雖然現(xiàn)在對(duì)于lncRNA的三維結(jié)構(gòu)了解較少，但lncRNAs與蛋白質(zhì)、DNA、RNA和金屬離子等其他分子相互作用，形成合適的三級(jí)結(jié)構(gòu)來(lái)發(fā)揮其功能，這一點(diǎn)越來(lái)越明顯。lncRNA影響各種生物過(guò)程的潛在分子機(jī)制，包括染色質(zhì)修飾、表觀遺傳調(diào)控、基因轉(zhuǎn)錄和翻譯、RNA轉(zhuǎn)換和基因組防御等，已被廣泛綜述[16]。lncRNA作為重要的調(diào)控因子，已成為腫瘤防治的研究熱點(diǎn)。LCAL1定位于染色體6q14.1，產(chǎn)生有三個(gè)外顯子轉(zhuǎn)錄本，在亞細(xì)胞定位中顯示了LCAL1在細(xì)胞核中富集。ENCODE數(shù)據(jù)庫(kù)顯示去氧核糖核酸酶和轉(zhuǎn)錄因子在LCAL1上游結(jié)合，提示LCAL1啟動(dòng)子有調(diào)控活性。有研究[17]發(fā)現(xiàn)使用siRNA 1和siRNA 2敲除H322M和HCC95細(xì)胞系中的LCAL1，結(jié)果顯示細(xì)胞生長(zhǎng)減少；在控制細(xì)胞系BEAS-2B中，穩(wěn)定的過(guò)表達(dá)LCAL1，使用兩個(gè)不同的克隆，從第2天開(kāi)始，到第6天實(shí)驗(yàn)結(jié)束，細(xì)胞增殖活性增強(qiáng)。從上述實(shí)驗(yàn)可得出LCAL1促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖。

本研究顯示，NSCLC組織中LCAL1表達(dá)水平高于配對(duì)癌旁正常組織，提示LCAL1可能與癌細(xì)胞的增殖有關(guān)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，腫瘤直徑>3 cm的LCAL1陽(yáng)性表達(dá)高于腫瘤直徑≤3 cm，可能的原因是腫瘤直徑可反映腫瘤負(fù)荷情況，LCAL1在腫瘤體積較大的患者中合成與釋放的更多；T2～T4期的LCAL1陽(yáng)性表達(dá)高于T1期，提示NSCLC的惡性程度可能與LCAL1表達(dá)水平有關(guān)，LCAL1水平越高，NSCLC的惡性程度越高，猜測(cè)LCAL1參與了NSCLC的惡性轉(zhuǎn)化；組織LCAL1表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的LCAL1陽(yáng)性表達(dá)相對(duì)較高，提示LCAL1可能參與了NSCLC的侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程。此外，LCAL1高表達(dá)者生存率顯著低于LCAL1低表達(dá)者，提示LCAL1陽(yáng)性表達(dá)與NSCLC患者的預(yù)后不良相關(guān)，LCAL1可能調(diào)控腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲，提示其在預(yù)測(cè)NSCLC患者預(yù)后上有一定價(jià)值。

總之，LCAL1在肺癌組織中高表達(dá)，且與腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期及患者預(yù)后相關(guān)，可能在肺癌發(fā)生發(fā)展中有一定作用。但是，目前人們對(duì)于LCAL1肺癌的腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲、增殖、分化、轉(zhuǎn)移和凋亡等具體調(diào)控機(jī)制的了解仍非常有限，更深層次的機(jī)制仍有待進(jìn)一步的探索，盡管具體分子機(jī)制尚不清楚，但上述研究結(jié)果仍提示lncRNA LCAL1與NSCLC的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，并有可能成為評(píng)估NSCLC患者預(yù)后的新的指標(biāo)。