明華偉，何蕓，付光新，李彪，甘升遠(yuǎn)，邵學(xué)壘，夏德林

(1南充市中心醫(yī)院，四川南充 637000；2西南醫(yī)科大學(xué)口頜面修復(fù)重建和再生實(shí)驗(yàn)室；3西南醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院)

由于惡性腫瘤切除、創(chuàng)傷、嚴(yán)重感染及先天畸形等各種因素所致頜面部組織缺損，給患者身心帶來極大的負(fù)面影響，這使對(duì)創(chuàng)面進(jìn)行修復(fù)以恢復(fù)患者的功能及外觀顯得尤為迫切。皮瓣移植應(yīng)用于頜面部缺損的修復(fù)重建由來已久，其同時(shí)具有創(chuàng)面修復(fù)、功能重建等重要作用[1]。但有研究[2,3]報(bào)道，皮瓣移植術(shù)后部分壞死率達(dá)11.4%，完全壞死率為4.0%～6.3%；術(shù)后一旦出現(xiàn)皮瓣血運(yùn)障礙、缺血壞死，臨床處理會(huì)非常棘手[4]。因此，如何提高缺血皮瓣的存活能力是修復(fù)重建外科一直以來研究的重點(diǎn)。血管生成是由血管內(nèi)皮祖細(xì)胞原位聚集、增殖分化、發(fā)育成血管系統(tǒng)的一個(gè)需要多種細(xì)胞因子參與的復(fù)雜過程[5]。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)及骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)在成骨及成血管方面發(fā)揮極為重要的生物學(xué)作用，骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)及臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)共培養(yǎng)后，兩者分泌的VEGF與BMP之間存在著相互促進(jìn)、級(jí)聯(lián)放大的作用[6]。VEGF被認(rèn)為是作用最直接、特異性最高的一種促血管化生長因子，其中VEGF 165在體內(nèi)含量最為豐富，促血管化作用最強(qiáng)[7～10]。但VEGF在體內(nèi)半衰期短，局部應(yīng)用很快被周圍組織液稀釋。將VEGF 165基因?qū)際UVEC后再與BMSC共移植，在體內(nèi)是否能夠持續(xù)釋放VEGF促進(jìn)缺血皮瓣的血管生成以往鮮有報(bào)道。本研究通過制備大鼠背部缺血皮瓣模型，并移植BMSCs、VEGF 165基因修飾的HUVEC(VEGF 165-HUVEC)，觀察兩者共移植對(duì)缺血皮瓣存活能力的影響

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6～8周齡雌性SD大鼠50只，體質(zhì)量180～200 g；4周齡雄性SD大鼠2只，體質(zhì)量250～300 g；均由西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 HUVECs、pHBAd-MCMV-GFP-VEGF165及試劑、儀器 HUVECs(Sciencell公司)；pHBAd-MCMV-GFP-VEGF165(由漢恒生物科技公司包裝、構(gòu)建及鑒定)；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(HyClone公司)、EGM-2(Lonza公司)、血管內(nèi)皮生長因子抗原、ELISA檢測(cè)試劑盒、兔抗大鼠CD31抗體(一抗)、羊抗兔IgG(二抗，碧云天生物科技有限公司)；倒置相差顯微鏡(奧林巴斯)。

1.3 BMSCs和HUVEC的培養(yǎng)、計(jì)數(shù)、定容 全骨髓貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)雄性SD大鼠股骨、脛骨骨髓。當(dāng)細(xì)胞增殖達(dá)到90%融合時(shí)進(jìn)行胰酶消化傳代，傳至第3代后制成單細(xì)胞懸液，離心后重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)、定容至1 mL培養(yǎng)液含1×106個(gè)BMSCs備用。從液氮容器中取出HUVECs，常規(guī)復(fù)蘇后將按比例接種、傳代。傳至第3代后制成單細(xì)胞懸液，離心后重懸細(xì)胞，同樣定容至1 mL培養(yǎng)液含1×106個(gè)HUVEC備用。

1.4 腺病毒介導(dǎo)VEGF-165基因轉(zhuǎn)染HUVEC第3代HUVEC 在前期體外實(shí)驗(yàn)中[11]，我們通過VEGF 165-HUVEC的MOI摸索時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)MOI=30時(shí)為其最佳感染復(fù)數(shù)，故在本實(shí)驗(yàn)中采用MOI=30進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染。參照病毒轉(zhuǎn)染說明書步驟操作，將腺病毒介導(dǎo)攜帶VEGF 165基因重組pHBAd-MCMV-GFP-VEGF165質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HUVEC。

1.5 缺血皮瓣模型制備、分組及BMSCs和VEGF 165-HUVEC共移植 SD大鼠經(jīng)10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔麻醉，備皮后在大鼠背部設(shè)計(jì)隨意皮瓣(4.0 cm×1.5 cm)，并于皮瓣中軸線上等距離處標(biāo)記三個(gè)注射點(diǎn)，銳性分離掀起皮瓣，再對(duì)位縫合，術(shù)后創(chuàng)口涂布紅霉素眼膏，無需敷料包扎。所有動(dòng)物模型由同一組人員制備，大鼠術(shù)后分籠飼養(yǎng)。建模成功(缺血皮瓣制備手術(shù)過程順利，手術(shù)探查確認(rèn)皮瓣無軸心血管，手術(shù)過程中及術(shù)后取材前未死亡，麻醉蘇醒后能正常活動(dòng))后所有大鼠隨機(jī)分為5組各10只，術(shù)后即刻在標(biāo)記點(diǎn)(分別距離皮瓣遠(yuǎn)蒂端1、2、3 cm處)皮下組織層移植等量細(xì)胞5×105個(gè)，A組移植BMSCs與VEGF 165-HUVEC(1∶1)，B組移植VEGF 165-HUVEC，C組移植BMSCs與HUVEC(1∶1)，D組移植HUVEC，E組注射等體積0.9%NaCl溶液。

1.6 皮瓣存活率測(cè)算 術(shù)后第11天，數(shù)碼相機(jī)對(duì)各組皮瓣拍照，采用 Image-Pro Plus 6.0軟件分析、計(jì)算各組皮瓣存活率(每組10只大鼠)，皮瓣存活率(%)=皮瓣總面積(cm2)-皮瓣壞死面積(cm2)/皮瓣總面積(cm2)。

1.7 大鼠血清VEGF蛋白檢測(cè) 于術(shù)后第2、4、7、14天采用經(jīng)眼眶后靜脈叢采血法抽取大鼠外周血0.5～1.0 mL，離心取血清，采用ELISA法檢測(cè)血清中VEGF(第2、4、7天VEGF水平檢測(cè)時(shí)大鼠數(shù)為10只，第14天VEGF水平測(cè)定時(shí)大鼠數(shù)為5只)。

1.8 皮瓣微血管密度(MVD)測(cè)算 術(shù)后第11天，各組隨機(jī)抽取5只大鼠，麻醉過量處死后于皮瓣存活區(qū)域取材，行CD31免疫組化，檢測(cè)皮瓣MVD。在每組中隨機(jī)抽取10張切片，于200倍光鏡下每張隨機(jī)計(jì)算20個(gè)視野中的血管斷面數(shù)目，求均值計(jì)算各組皮瓣的MVD值[12]。皮瓣MVD(條/mm2)=第1個(gè)視野血管斷面數(shù)目(N1)+N2+、+N20/20。

2 結(jié)果

2.1 各組術(shù)后第11 天皮瓣存活率比較 A、B、C、D、E組皮瓣存活率分別為84.3%±4.7%、61.2%±4.5%、50.1%±3.8%、43.8%±2.9%、30.7%±1.9%，兩兩比較，P均<0.05。

2.2 各組不同時(shí)點(diǎn)血清VEGF蛋白水平比較 血清VEGF蛋白水平比較見表1。

組別 VEGF蛋白 術(shù)后第2天術(shù)后第4天術(shù)后第7天術(shù)后第14天 A組486.3±7.5?583.7±13.4?682.5±12.6?274.2±7.1?B組352.3±4.8435.2±6.9550.2±9.7215.5±5.8C組34.8±2.935.6±3.229.1±2.826.9±1.9D組33.1±2.031.2±3.727.9±2.824.7±2.1E組33.2±3.630.7±2.833.2±2.725.7±1.8

注：與其余4組比較，*P<0.05。

2.3 各組皮瓣局部MVD計(jì)數(shù)比較 A、B、C、D、E組MVD計(jì)數(shù)分別為62.1±5.2、53.7±4.8、40.5±3.1、25.9±3.0、17.8±1.1，兩兩比較，P均<0.05。

3 討論

口腔頜面部常因手術(shù)切除良惡性腫瘤、頜面部創(chuàng)傷、間隙感染及發(fā)育性畸形等各種因素所致組織缺損，從而導(dǎo)致面部畸形，嚴(yán)重影響患者的吞咽、言語等生理功能及日常生活，不可避免的給這類患者的身心健康造成較大的影響。臨床選用何種方法對(duì)組織缺損來進(jìn)行修復(fù)重建，才能盡可能恢復(fù)較為正常的生理功能及面部外形顯得尤為迫切。皮瓣移植自應(yīng)用于口腔頜面部軟組織缺損的修復(fù)重建以來，取得了較為滿意的臨床效果，其兼具創(chuàng)面修復(fù)、功能重建等重要作用。但是皮瓣移植后由于局部壓迫、血栓形成等各種復(fù)雜的局部或全身因素造成其血流動(dòng)力學(xué)發(fā)生變化，最終導(dǎo)致皮瓣因缺血而發(fā)生局部或全部壞死。皮瓣移植術(shù)后一旦出現(xiàn)血運(yùn)障礙、缺血壞死，臨床處理較為棘手，往往需再次或多次手術(shù)，增加了患者的創(chuàng)傷及醫(yī)療費(fèi)用，如何提高缺血皮瓣的存活能力一直以來是臨床研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。

BMSCs是一種存在于骨髓中的非造血干細(xì)胞，具有自我復(fù)制及多向分化的干細(xì)胞潛能，在體外特定的誘導(dǎo)環(huán)境中可以向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等方向分化，經(jīng)體外培養(yǎng)后不影響其增殖、分化能力。HUVEC來源豐富,取材、操作方便,不像胚胎干細(xì)胞涉及安全性及倫理學(xué)問題，且具有干細(xì)胞的功能-能夠無限次(理論上)增殖傳代。VEGF已被公認(rèn)為是在血管生成中發(fā)揮重要作用的促血管化生長因子，包括五種異構(gòu)體，其中VEGF 121和VEGF 165兩種蛋白質(zhì)是主要的分泌成分和效應(yīng)因子[13,14]。而VEGF 165在體內(nèi)含量最為豐富，促血管化作用最強(qiáng)[15]。國內(nèi)外學(xué)者利用VEGF促血管化研究的實(shí)施方案包括對(duì)其進(jìn)行蛋白重組和基因轉(zhuǎn)染這兩種形式。但是經(jīng)過蛋白重組后的VEGF應(yīng)用于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，其半衰期非常短，很快就會(huì)溶解于周圍組織液當(dāng)中并降解而失去生物學(xué)活性，無法持續(xù)、穩(wěn)定地發(fā)揮促血管生成的作用；通過血液循環(huán)途徑不能精準(zhǔn)定位至損傷局部發(fā)揮作用，且需要多次給藥，不可避免地增加了經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。近年來，大多數(shù)學(xué)者將目光投向基因轉(zhuǎn)染這個(gè)方式，通過將目的基因?qū)胨拗骷?xì)胞后讓自身源源不斷的合成效應(yīng)蛋白，從而能夠在體內(nèi)持續(xù)發(fā)揮促血管生成的生物學(xué)效應(yīng)[16]。應(yīng)用HUVEC與BMSCs共培養(yǎng)體系時(shí)，利用它們之間分泌的細(xì)胞因子在生物學(xué)功能方面產(chǎn)生偶聯(lián)協(xié)同效應(yīng)，加速血管生成，相互促進(jìn)，相互影響。本研究顯示，各組皮瓣存活率兩兩比較有差異，且A組皮瓣成活質(zhì)量明顯高于其他四組。

有研究發(fā)現(xiàn)[17]，BMSCs與HUVEC在共培養(yǎng)條件下，除HUVEC自身能夠分泌VEGF 165外，還能增加BMSCs合成和分泌VEGF 165，兩者分泌的VEGF 165共同促進(jìn)了HUVEC的分裂、增殖、遷移以及血管芽的形成。本研究顯示，A組VEGF蛋白表達(dá)水平并未明顯升高，C、D、E組各時(shí)間點(diǎn)的VEGF水平波動(dòng)較小。我們分析，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是由于HUVEC和BMSCs自身能分泌多種促血管化生長因子，如VEGF、bFGF、PDGF等，這些促血管化因子通過一系列復(fù)雜的生物學(xué)效應(yīng)發(fā)揮了血管生成的作用，一定程度上提高了皮瓣存活率，但是這些促血管化生長因子的量較少，在全身血液循環(huán)過程中被稀釋。而本實(shí)驗(yàn)經(jīng)大鼠眼眶后靜脈叢采血離心后檢測(cè)VEGF水平，其局部產(chǎn)生的VEGF蛋白經(jīng)全身血液循環(huán)至眼眶后靜脈時(shí)已被大量稀釋，C、D組皮瓣局部實(shí)際的VEGF水平應(yīng)該明顯高于實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的結(jié)果。比較B、D組的VEGF蛋白水平，我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染基因的HUVEC在體內(nèi)能持續(xù)高表達(dá)VEGF蛋白，結(jié)合兩組相應(yīng)的皮瓣存活率及MVD表明，VEGF發(fā)揮了促血管生成的作用；A組皮瓣存活率高于B、C組，轉(zhuǎn)染基因的HUVEC與BMSCs共移植后VEGF表達(dá)水平明顯高于單獨(dú)共移植或單獨(dú)轉(zhuǎn)染基因，A、B、C組皮瓣MVD數(shù)據(jù)比較同樣印證該結(jié)果。有研究[18]發(fā)現(xiàn)，在BMSCs與HUVEC共培養(yǎng)體系中，HUVEC分泌的尿激酶類纖容酶原激活劑(uPA)和VEGF受體增加，同時(shí)BMSCs中VEGF 165的表達(dá)也上調(diào)，VEGF 165進(jìn)而活化HUVEC中uPA，uPA與血管內(nèi)皮鈣粘蛋白可能一起啟動(dòng)了共培養(yǎng)細(xì)胞的自組裝進(jìn)網(wǎng)絡(luò)以及細(xì)胞的遷移、增殖、分化。Kaigler等[19]發(fā)現(xiàn)，在BMSCs與血管內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)體系中，BMSCs能分泌VEGF來促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的分裂、增殖分化形成血管芽狀結(jié)構(gòu)。還有研究發(fā)現(xiàn)[20～23]，共培養(yǎng)的VECs可以釋放BMP-2，一方面促進(jìn)成骨分化，另一方面還可以促進(jìn)成骨及其前體細(xì)胞分泌VEGF，VEGF反過來作用于VECs，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的分裂、增殖、分化及血管形成。兩者相互促進(jìn)，起到級(jí)聯(lián)放大的作用，共同促進(jìn)血管生成。

總之，BMSCs與VEGF 165-HUVEC共移植入大鼠背部缺血皮瓣后，在體內(nèi)能持續(xù)高表達(dá)VEGF蛋白，大鼠背部缺血皮瓣的存活率及皮瓣局部的MVD明顯增加，具有提高缺血皮瓣存活的能力。