何思羽，王清

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，四川瀘州 646000)

多發(fā)性骨髓瘤(MM)是一種起源于漿細(xì)胞異常增生的單克隆惡性腫瘤性疾病，常伴有不同程度的骨損害，表現(xiàn)為骨骼破壞、頑固性疼痛、病理性骨折、高鈣血癥及脊髓受壓等，又稱之為骨髓瘤骨病(MBD)，是第二常見的血液系統(tǒng)惡性腫瘤[1]。近年來，隨著蛋白酶體抑制劑(PIS)、免疫調(diào)節(jié)藥物(IMID)的應(yīng)用及自體干細(xì)胞移植(ASCT)的進(jìn)行極大改善了MM患者的預(yù)后，然而當(dāng)前仍無法完全治愈，預(yù)計2018年在美國MM的死亡可能會達(dá)到1 2000人[1，2]。研究[3,4]發(fā)現(xiàn)，分子細(xì)胞遺傳學(xué)異常與克隆異質(zhì)性和克隆進(jìn)化關(guān)系密切，在MM發(fā)病中發(fā)揮著重要作用。高危細(xì)胞遺傳學(xué)異常患者更容易出現(xiàn)克隆異質(zhì)性和克隆進(jìn)化現(xiàn)象，與疾病的發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)，故針對MM的臨床和生物學(xué)上的異質(zhì)性，從分子水平探索其治病機(jī)制，開發(fā)精準(zhǔn)治療方案，進(jìn)一步改善患者預(yù)后，提高生命質(zhì)量具有重要意義。高通量信息技術(shù)的發(fā)展為疾病基因改變的研究帶來了巨大便利，利用生物信息分析學(xué)方法有助于探索分子改變與疾病預(yù)后的關(guān)系，快速挖掘有效的分子靶標(biāo)，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)腫瘤精準(zhǔn)治療的研究方向[5，6]。本研究采用生物信息分析學(xué)方法從GEO數(shù)據(jù)庫下載并整理有關(guān)MM基因微陣列數(shù)據(jù)，獲得腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中顯著差異表達(dá)基因(DEGs)，從而篩選出可能參與MM發(fā)生發(fā)展的基因，旨在為探索MM的發(fā)病機(jī)制、診斷及治療提供基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 資料搜集 利用NCBI中基因芯片公共數(shù)據(jù)庫(GEO)芯片數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.go)，以“multiple myeloma，Homo”為關(guān)鍵詞搜索目標(biāo)芯片。經(jīng)篩選后，采用由Liu等提交以GPL10558 Illumina HumanHT-12 V4.0 expression beadchip為平臺的基因芯片GSE113295。該芯片共18例樣本，由12例完全緩解MM骨髓樣本和6例正常樣本構(gòu)成。

1.2 MM的差異表達(dá)基因分析 應(yīng)用GEO數(shù)據(jù)庫基于R語言中GEOquery[7]和limma[8]程序包的在線分析工具GEO2 R(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)以P<0.05、|logFC|>1.5為條件篩選出GSE113295芯片的差異基因。

1.3 MM的差異表達(dá)基因基因功能富集分析及調(diào)控通路分析 使用DAVID6.8(The Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery)在線分析工具(https://david.ncifcrf.gov/)以P<0.05為條件篩選出的差異基因進(jìn)行GO功能注釋和KEGG信號通路富集分析。GO是識別并注釋高通量基因組或轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的生物學(xué)特性的常用分析方法，可按照生物途徑分為生物學(xué)過程(BP)、分子功能(MF)以及細(xì)胞組成(CC)。KEGG通路富集分析則顯示差異基因富集的信號通路。

1.4 MM的差異表達(dá)基因所調(diào)控蛋白互作網(wǎng)絡(luò)與關(guān)鍵基因分析 使用蛋白互作數(shù)據(jù)庫(STRING，http://string-db.org/)，分析MM骨髓樣本和正常樣本差異表達(dá)基因所編碼蛋白的相互作用關(guān)系，以互作評分combination score>0.4為條件構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)。然后將STRING中得到的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape軟件，使用網(wǎng)絡(luò)分析cytoHubba插件計算網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)的點(diǎn)度中心性(DC)、中介中心性(BC)以及接近中心性(CC)，取這3個參數(shù)前10名的基因，并取交集。

2 結(jié)果

2.1 MM的差異表達(dá)基因的篩選結(jié)果 按照篩選條件，在GSE113295基因芯片中MM樣本和正常樣本的差異表達(dá)基因共1 380個，其中上調(diào)1 274個，下調(diào)6個。按照差異倍數(shù)|logFC|大小排序，前三個上調(diào)基因?yàn)榱u基17-β脫氫酶13(HSD17B13)、UNC-5家族c-終端(UNC5CL)、GLI家族鋅指蛋白1(GLI1)，前三個下調(diào)基因過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARG)、MLC成員肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈5(MYL5 )、脂連蛋白(ADIPOQ)。

2.2 MM的差異表達(dá)基因GO功能和調(diào)控通路分析結(jié)果 MM的差異表達(dá)基因GO功能在生物學(xué)層面上主要介導(dǎo)免疫反應(yīng)、細(xì)胞通訊、細(xì)胞黏附、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程；在細(xì)胞組分層面上主要參與細(xì)胞質(zhì)膜組成、整合及胞外間隙的調(diào)控；在分子功能層面主要富集于G蛋白偶聯(lián)受體活性、細(xì)胞黏附分子活性、結(jié)構(gòu)因子活性、細(xì)胞因子活性。KEGG信號通路分析顯示，差異表達(dá)基因主要調(diào)控神經(jīng)活性配體—受體相互作用、細(xì)胞黏附分子(CAMs)、過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)信號通路(詳見表1)。

表1 在生物學(xué)過程、細(xì)胞組分、分子功能層面發(fā)揮不同功能及調(diào)控不同信號通路的差異表達(dá)基因

注：基因數(shù)量超過20個者只列舉20個基因名稱。

2.3 MM的差異表達(dá)關(guān)鍵基因的篩選結(jié)果 以MM差異表達(dá)基因構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，除去孤立無互作的蛋白節(jié)點(diǎn)，篩選出230個具有相互作用關(guān)系的蛋白質(zhì)，構(gòu)成了包含有507個互作邊關(guān)系的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)。在復(fù)雜的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中應(yīng)用cytoHubba插件按照DC、BC以及CC的大小排序，集算出排名前10的中心節(jié)點(diǎn)。對這三個參數(shù)得出的結(jié)果取交集，從而挖掘其中7個關(guān)鍵基因全長重組蛋白(BUB1B)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARG)、絲裂原活化蛋白激酶14(MAPK14)、酪氨酸激酶(FYN)、白介素6(IL-6)、肌醇1，4，5-三磷酸3-激酶B(ITPKB)、zeste同源物2(ZH2)，更有可能參與MM的發(fā)生發(fā)展，為進(jìn)一步探索MM的發(fā)病機(jī)制，發(fā)現(xiàn)治療MM的生物靶點(diǎn)提供基礎(chǔ)。

3 討論

MM是一種無法治愈的惡性克隆性漿細(xì)胞腫瘤，有嚴(yán)重的骨痛、病理性骨折、椎體壓縮性骨折等骨相關(guān)事件，甚至導(dǎo)致患者反復(fù)骨折[9]，多發(fā)于老年，在并發(fā)骨質(zhì)疏松癥的情況下，易被漏診[10,11]，嚴(yán)重影響患者的生命質(zhì)量。由此，進(jìn)一步尋找有助于腫瘤快速診斷和治療的分子靶標(biāo)迫在眉睫。在本研究中，我們使用了GEO2R在線工具分析了GEO中的芯片數(shù)據(jù)GSE113295，包含了12例完全緩解MM樣本和6例正常樣本，得到了1 380個的差異基因。通過DAVID對DGEs進(jìn)行GO功能注釋和KEGG信號通路分析，發(fā)現(xiàn)差異基因主要參與了化學(xué)突觸傳遞、ERK 1和ERK 2級聯(lián)的正調(diào)節(jié)、酶活性的正調(diào)節(jié)、鈣離子結(jié)合、延遲整流鉀通道活性等；主要由神經(jīng)活性配體-受體相互作用、PPAR信號通路、細(xì)胞黏附分子、脂肪酸合成等通路介導(dǎo)。本研究結(jié)果驗(yàn)證了Saltarella等[12]的結(jié)論，血漿水平里與化學(xué)突觸傳遞相關(guān)的細(xì)胞因子和血管生成因子FGF-2、HGF、VEGF和PDGF-β水平對治療反應(yīng)有預(yù)測意義，有助于描述不同的危險組對治療結(jié)果和療效的影響；FGF-2與MM的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[13,14]。鈣離子結(jié)合信號通路也是介導(dǎo)MM發(fā)生的關(guān)鍵病因之一，研究發(fā)現(xiàn)非選擇性陽離子通道瞬時受體電位香草酸(TRPV2)可通過鈣依賴磷酸酶NFAT信號通路調(diào)節(jié)MM中破骨細(xì)胞分化，為MM治療的策略提供新的思路。ERK 1和ERK 2級聯(lián)的正調(diào)節(jié)是腫瘤發(fā)生發(fā)展中的經(jīng)典通路之一，研究發(fā)現(xiàn)磷酸化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK1/2)的高表達(dá)提示MM預(yù)后不良[15]；B-Raf V600E抑制劑Rafoxanide通過增強(qiáng)DNA損傷反應(yīng)和抑制p38 MAPK通路，引發(fā)MM細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期停滯[16]；敲除活化C激酶1受體基因同樣可以通過激活P-P38和P-ERK在MAPK/ERK信號通路減少M(fèi)M細(xì)胞的增殖[17]。

運(yùn)用蛋白互作數(shù)據(jù)庫STRING以及Cytoscape軟件分析DGEs，獲得7個關(guān)鍵基因BUB1B、PPARG、MAPK14、FYN、IL6、ITPKB、ZH2。BUB1B基因通過CDC20/CCNB軸促進(jìn)MM細(xì)胞增殖，對于高風(fēng)險MM患者，可能成為MM治療的潛在靶點(diǎn)[18]。過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARG)多態(tài)性與MM患者的頜骨唑來膦酸相關(guān)性骨壞死(BRONJ)相關(guān)[19]；PPARG中SNP的存在可能與早期BRONJ的風(fēng)險增加有關(guān)[20]。IL-6作為破骨細(xì)胞分化調(diào)節(jié)劑，與祖細(xì)胞結(jié)合時促進(jìn)破骨細(xì)胞生成，過度豐富時又導(dǎo)致過度的破骨細(xì)胞活性和骨質(zhì)溶解，與MM的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[21]。LYN基因?yàn)閟rc家族激酶成員是IL6信號通路的關(guān)鍵介質(zhì)，可能成為治療MM的關(guān)鍵靶點(diǎn)[22]。尚未發(fā)現(xiàn)肌醇-1，4，5-三磷酸3-激酶-B(ITPKB)、zeste同源物2(ZH2)基因在MM發(fā)生發(fā)展中有明確的相關(guān)性。但是，在結(jié)腸癌組織和鄰近部分中同樣檢測到ITPKB的差異表達(dá)，并且發(fā)現(xiàn)miR-410可通過抑制ITPKB基因表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖并減少細(xì)胞凋亡[23]；MicroRNA-31通過下調(diào)ZH2基因的表達(dá)來觸發(fā)G2/M細(xì)胞周期停滯，增強(qiáng)化學(xué)敏感性并抑制人胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲[24]。為探索MM的發(fā)生發(fā)展，尋找新的作用靶點(diǎn)提供了新的思路。

總之，利用生物信息分析學(xué)方法篩選出MM的關(guān)鍵差異表達(dá)基因，一方面通過GO功能注釋、KEGG信號通路驗(yàn)證了多個相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，為今后實(shí)驗(yàn)奠定了牢固的理論基礎(chǔ)，另一方面篩選出BUB1B、PPARG、MAPK14、FYN、IL6、ITPKB、ZH2共7個關(guān)鍵基因，雖尚不能確定ITPKB、ZH2基因與MM有明確關(guān)系，但現(xiàn)有研究結(jié)果為MM發(fā)病機(jī)制研究提供了新的思路，可以為后續(xù)臨床治療等方面的研究提供幫助。