朱志義，竇中嶺

(1河南科技大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，河南洛陽(yáng) 471003；2河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院)

前列腺癌是常見的男性泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)病率居男性惡性腫瘤第一位[1]。2000～2011年，我國(guó)前列腺癌發(fā)病率及病死率持續(xù)增長(zhǎng)，2015年我國(guó)前列腺癌發(fā)病率為60.3/10萬(wàn)例、病死率26.6/10萬(wàn)例[2]，嚴(yán)重影響男性健康。近年來(lái)前列腺癌診斷和治療水平得到極大提高，但確切病因及發(fā)病機(jī)制尚不清楚，晚期轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者病死率較高[3]。微小RNA(miRNA)是一段內(nèi)源性、非編碼、18～25個(gè)核苷酸的RNA序列，可通過結(jié)合mRNA的3′UTR，誘導(dǎo)mRNA降解或抑制mRNA的翻譯發(fā)揮作用，影響細(xì)胞分化、增殖、侵襲和凋亡等過程。多種miRNA的異常表達(dá)與前列腺癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，miR-34家族包括miR-34a、miR-34b及miR-34c,miR-34c基因位于11q23,其在結(jié)腸癌、喉癌等腫瘤組織中miR-34c表達(dá)下調(diào)[4～7]。編碼受體酪氨酸激酶的肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(c-Met)是較早鑒定的原癌基因，肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)是其主要配體，c-Met/HGF在不同組織具有不同的生物學(xué)功能，與器官再生、腫瘤形成過程中促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂有關(guān)[8]。在膠質(zhì)細(xì)胞瘤、黑素瘤、結(jié)腸直腸癌、乳腺癌等許多腫瘤組織中均存在c-Met過度表達(dá)現(xiàn)象，與腫瘤浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后有關(guān)，抑制c-Met表達(dá)是一種新的腫瘤治療方式[9]。近年前列腺癌組織中c-Met表達(dá)情況研究結(jié)果尚不一致。本研究觀察了前列腺癌組織中miR-34c、c-Met mRNA的表達(dá)情況，分析其與前列腺癌臨床病理參數(shù)、預(yù)后的關(guān)系，并探討兩者在前列腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2011年9月～2013年9月河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的前列腺癌患者63例，年齡55～78(67.54±7.80)歲；術(shù)中獲取前列腺癌組織標(biāo)本，術(shù)后均經(jīng)病理檢查確診。根據(jù)Gleason評(píng)分系統(tǒng)進(jìn)行病理分級(jí)，參照《中國(guó)泌尿外科疾病診斷治療指南》推薦的標(biāo)準(zhǔn)[10]分組如下：Gleason評(píng)分≤6分29例、Gleason評(píng)分≥7分34例；參照2002年美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)前列腺癌TNM分期Ⅰ～Ⅱ期27例、Ⅲ～Ⅳ期36例；前列腺癌患者初始血清前列腺特異抗原(PSA)8.3～131 ng/mL,平均35.6 ng/mL，其中≤10 ng/mL者11例、10～20 ng/mL者33例、>20 ng/mL者19例；均檢測(cè)血清堿性磷酸酶、X線、MRI、核素骨掃描等檢查后明確遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移14例、無(wú)轉(zhuǎn)移49例。前列腺癌患者術(shù)后隨訪2～60個(gè)月，平均47.7個(gè)月，以門診或電子通訊方式，定期進(jìn)行直腸指檢、血清PSA、B超及MRI等檢查，隨訪至2018年9月30日或患者死亡。另選同期因前列腺增生接受恥骨上前列腺摘除術(shù)的患者45例，年齡58～80(66.57±7.12)歲;術(shù)中獲取的組織標(biāo)本,術(shù)后均經(jīng)病理檢查確診。兩組患者均為初次診斷，術(shù)前均未接受其他治療，并排除其他惡性腫瘤。組織經(jīng)液氮速凍后，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。本研究?jīng)河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過，患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 組織miR-34c、c-Met mRNA檢測(cè)方法 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。TRIzol法提取細(xì)胞中總RNA。以3 μL總RNA為模板，用TaqMan逆轉(zhuǎn)錄試劑盒在ABI prism 7500熒光定量PCR儀上進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)條件：16 ℃、30 min，42 ℃、30 min，85 ℃、5 min。miR-34c特異性莖環(huán)引物：5′-CGCGAGGCAGTGTAGTTAGCT-3′，5′-AGTGCAGGG-TCCGAGGTATT-3′；內(nèi)參基因U6:5′-GCTTCGGCAG-CACATATACTAAAAT-3′，:5′-CGCTTCACGAATTTG-CGTGTCAT-3′，c-Met:5′-TGAAATTCATCCAACCAA-ATCTT-3′,5′-AATAGAAAACTGACAATGTTGAGAG-G-3′。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)總反應(yīng)體系20 μL中，含1 μL cDNA、1 μL 引物對(duì)、8 μL Power SYBR Green Master Mix試劑、10 μL不含RNase去離子純水，反應(yīng)條件：95 ℃、3 min，95 ℃、30 s,60 ℃、30 s，40個(gè)循環(huán)。所有反應(yīng)均在ABI 7500PCR儀上完成，每個(gè)樣本重復(fù)3次。用2-ΔΔCt表示受檢組織中miRNA-34c、c-Met mRNA相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 前列腺癌組織、前列腺增生組織中miR-34c、c-Met mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 前列腺癌組織、前列腺增生組織中miR-34c相對(duì)表達(dá)量分別為0.521±0.426、1.247±0.681，c-Met mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為2.527±0.348、1.056±0.217，兩者比較，P均<0.05。前列腺癌組織、前列腺增生組織中miR-34c相對(duì)表達(dá)量分別為0.521±0.426、1.247±0.681，c-Met mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為2.527±0.348、1.056±0.217，兩者比較，P均<0.05。

2.2 前列腺癌組織miR-34c、c-Met mRNA表達(dá)的相關(guān)性 前列腺癌組織miR-34c、c-Met mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.630，P=0.002)。

2.3 miR-34c、c-Met mRNA表達(dá)與前列腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 結(jié)果見表1。

表1 miR-34c、c-Met mRNA表達(dá)與前列腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

注：由表1可知miR-34c表達(dá)與前列腺癌患者Gleason評(píng)分和TNM分期有關(guān)(P均<0.05)，c-Met mRNA表達(dá)與前列腺癌患者Gleason評(píng)分、TNM分期及有無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.05)。

2.4 miR-34c、c-Met mRNA表達(dá)與前列腺癌患者預(yù)后的關(guān)系 以前列腺癌組織中miR-34c、c-Met mRNA相對(duì)表達(dá)量的中位數(shù)為界，分別將63例前列腺癌患者分為miR-34c高表達(dá)者33例與miR-34c低表達(dá)者30例、c-Met mRNA高表達(dá)者35例與c-Met mRNA低表達(dá)者28例。miR-34c高表達(dá)者3、5年 總體生存率(OS)分別為84.85%(28/33)、60.61%(22/33)，miR-34c低表達(dá)者分別為70.00%(21/30)、40.00%(13/30)，分析表明miR-34c高表達(dá)者3、5年 OS均顯著高于低表達(dá)者(χ2分別為5.387、7.627，P均<0.05)；前列腺癌患者中c-Met mRNA高表達(dá)者3、5年 OS分別為68.51%(24/35)、37.14%(13/35)，c-Met mRNA低表達(dá)者分別為89.29%(25/28)、78.57%(22/28)，分析表明c-Met mRNA高表達(dá)者3、5年 OS顯著低于c-Met mRNA低表達(dá)者(χ2分別為5.808、9.807，P均<0.05)。

3 討論

前列腺癌是常見的泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，近年發(fā)病率有逐漸增加的趨勢(shì)[1]。近年來(lái)隨著分子遺傳學(xué)和腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制研究的深入，出現(xiàn)許多新的診斷治療方法及藥物，如基因治療、免疫治療等，改善患者生存質(zhì)量，延長(zhǎng)患者生存時(shí)間。但目前對(duì)晚期前列腺癌、激素抵抗性前列腺癌等，目前臨床仍無(wú)有效的治療方案。因此有必要深入研究前列腺癌的分子機(jī)制，尋找新的診斷治療靶點(diǎn)。miRNA廣泛存在于真核細(xì)胞中，作為內(nèi)源性非編碼RNA，其前體在Dicer酶加工后形成具有莖環(huán)二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)合于mRNA的3′非編碼區(qū)，影響mRNA的穩(wěn)定性，影響基因的轉(zhuǎn)錄。目前大量研究表明[5,7]，miRNA通過影響癌基因及抑癌基因的表達(dá)，調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，影響腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、血管生成、親潤(rùn)轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)過程。研究[11]表明，miRNA參與多條細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)，如TGF-β傳導(dǎo)通路、雄激素受體傳導(dǎo)通路等，與前列腺癌細(xì)胞增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)。在結(jié)腸癌、非小細(xì)胞肺癌和肝細(xì)胞癌等19種腫瘤中均存在miR-34異常表達(dá)下調(diào)的現(xiàn)象。本研究中，前列腺癌組織中miR-34c的相對(duì)表達(dá)量明顯低于前列腺增生組織，表明前列腺癌組織中miR-34c表達(dá)下調(diào)，與以往研究[12]結(jié)果一致。其機(jī)制可能與miR-34c基因位點(diǎn)11q23雜合性缺失有關(guān)，也可能與表觀遺傳學(xué)修飾后miR-34c基因失活有關(guān)[13]。本研究中Gleason評(píng)分≥7分前列腺癌患者癌組織miR-34c表達(dá)量低于評(píng)分≤6分者，Ⅲ～Ⅳ期前列腺癌患者癌組織miR-34c表達(dá)量低于Ⅰ～Ⅱ期者，表明miR-34c的表達(dá)與腫瘤較高的TNM分期、病理分級(jí)有關(guān)。其機(jī)制可能是miR-34的表達(dá)受轉(zhuǎn)錄因子p53的調(diào)節(jié)，p53基因的突變或缺失多發(fā)生于高級(jí)別、進(jìn)展期前列腺癌中[14]，p53基因突變導(dǎo)致miR-34表達(dá)下降，因而在低級(jí)別、早期局限性前列腺癌中miR-34表達(dá)下降不明顯。本研究中miR-34c高表達(dá)組患者3、5年 OS顯著高于miR-34c低表達(dá)者，表明miR-34c高表達(dá)者患者與miR-34c低表達(dá)者患者相比預(yù)后較好，可能與miR-34c的抑癌作用有關(guān)。

c-Met是一種原癌基因，位于7q31上，其能編碼190 KD的跨膜糖蛋白，近年研究[15]發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)前列腺癌組織c-Met mRNA高表達(dá)與高Gleason評(píng)分密切相關(guān)。本研究結(jié)果表明，前列腺癌組織中c-Met的表達(dá)量明顯高于前列腺增生組織，表明前列腺癌組織中c-Met mRNA表達(dá)上調(diào)，其機(jī)制可能與c-Met原癌基因擴(kuò)增有關(guān)，也可能與缺氧導(dǎo)致HIF1α升高，進(jìn)而誘導(dǎo)c-Met基因表達(dá)增加有關(guān)[16]。本研究中Gleason評(píng)分≥7分前列腺癌患者癌組織c-Met表達(dá)量高于評(píng)分≤6分者，Ⅲ～Ⅳ期前列腺癌患者癌組織c-Met mRNA表達(dá)量高于Ⅰ～Ⅱ期者，有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移前列腺癌患者癌組織c-Met mRNA表達(dá)顯著高于無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者，表明c-Met mRNA表達(dá)與腫瘤較高的分期及病理分級(jí)有關(guān)，并且與腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)。其機(jī)制可能與前列腺癌細(xì)胞c-Met/HGF過度活化后，激活PI3K/ERK通路，下調(diào)E-鈣黏素表達(dá)，并誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，使腫瘤細(xì)胞獲得局部浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的能力[17]。本研究中c-Met高表達(dá)者3、5年 OS顯著低于c-Met低表達(dá)者，表明c-Met高表達(dá)提示患者的不良預(yù)后，可能與c-Met高表達(dá)患者分期、分級(jí)較高有關(guān)。

有研究[18]表明鼻咽癌、胃腸癌、肺癌中miR-34c能夠下調(diào)c-Met基因表達(dá)，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移及凋亡。本研究中，對(duì)前列腺癌組織中miR-34c與c-Met mRNA表達(dá)的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果表明二者呈負(fù)相關(guān)，提示二者可相互作用，共同促進(jìn)前列腺癌的發(fā)生發(fā)展。其相互作用的機(jī)制可能是c-Met表達(dá)活化PI3K/AKT/mTOR通路，mdm2表達(dá)增加進(jìn)而抑制p53蛋白功能[19，20]，p53基因激活促進(jìn)miR-34c表達(dá)，miR-34c進(jìn)而靶向抑制c-Met基因表達(dá)，從而形成一條反饋環(huán)路。