米志寬，隋麗欣，趙菊梅

(1延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院，陜西延安 716000；2延安市腫瘤防治研究重點(diǎn)研究室)

目前，我國(guó)胃癌篩查模式不完善，且不同的人群對(duì)篩查的認(rèn)知、態(tài)度不一，同時(shí)因人口基數(shù)大、老齡化趨勢(shì)明顯，胃癌發(fā)病率及病死率依然很高[1]。鹽霉素(SAL)具有抗腫瘤作用，并靶向作用于腫瘤干細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，促進(jìn)凋亡[2,3]。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)是綠茶中最主要的活性成分，其具有降低氧自由基、脂質(zhì)過氧化物及調(diào)節(jié)致癌物的代謝、抗病毒、廣譜抗菌的特性[4～7]。SAL和EGCG雖然各自有不同的抗腫瘤作用，但目前尚未見兩者聯(lián)合作用于胃癌細(xì)胞中的相關(guān)報(bào)道。本研究觀察了SAL聯(lián)合EGCG對(duì)人胃癌細(xì)胞株SGC-7901增殖、凋亡的影響，并探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 胃癌細(xì)胞、試劑及儀器 SGC-7901細(xì)胞(武漢博士德公司)；RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清、兔抗人bcl-2、bax抗體、羊抗兔二抗(武漢博士德公司)，EGCG、MTT、AO/EB凋亡試劑盒(美國(guó)Sigma公司)，β-actin、bcl-2、bax引物(由上海生工設(shè)計(jì)合成)；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices公司)，熒光顯微鏡(日本Nikon E400)，凝膠成像系統(tǒng)GENE(英國(guó)Syngene公司)。

1.2 SGC-7901細(xì)胞培養(yǎng) SGC-7901細(xì)胞采用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。

1.3 SAL、EGCG單獨(dú)及聯(lián)合干預(yù)24、48、72 h后SGC-7901細(xì)胞增殖抑制率測(cè)算 采用常規(guī)胰酶消化，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SGC-7901細(xì)胞，以每孔3×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h，后分組。聯(lián)合組：加入5、10、20、40 mg/L的EGCG及2 μmol/L的SAL；SAL組：加入1、2、4、8 μmol/L的SAL;EGCG組：加入5、10、20、40 mg/L的EGCG；對(duì)照組：無藥物，只加培養(yǎng)液。每組均設(shè)置5個(gè)平行孔，溫育24、48、72 h。每孔加入濃度為5 mg/mL的MTT溶液20 μL，培養(yǎng)4 h。吸凈上清液，每孔加DMSO 150 μL，振蕩10 min，使用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)為490 nm處的吸光度值(OD值)，對(duì)照組調(diào)零，各組細(xì)胞增殖能力以O(shè)D值表示。細(xì)胞增殖抑制率=(對(duì)照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值)/對(duì)照組OD值×100%，設(shè)定聯(lián)合組、SAL組、EGCG組為實(shí)驗(yàn)組。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)3次后取平均值。

1.4 SAL、EGCG單獨(dú)及聯(lián)合干預(yù)48 h后SGC-7901細(xì)胞熒光染色情況觀察 采用常規(guī)胰酶消化，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SGC-7901細(xì)胞，以2×105/mL接種于內(nèi)有干凈無菌蓋玻片的6孔板中，培養(yǎng)24 h后分組。聯(lián)合組：加入2 μmol/L的SAL和10 mg/L的EGCG；SAL組：加入2 μmol/L的SAL；EGCG組：加入10 mg/L的EGCG；對(duì)照組：無藥物，僅加培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h后棄培養(yǎng)液，PBS洗滌3次，按照試劑盒說明書進(jìn)行AO/EB熒光染色，夾出蓋玻片置于載玻片上，熒光顯微鏡觀察拍照。正常細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，細(xì)胞核形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，呈綠色熒光；凋亡細(xì)胞細(xì)胞核固縮，呈紅色熒光；死亡細(xì)胞細(xì)胞核形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，呈橘紅色熒光。

1.5 SAL、EGCG單獨(dú)及聯(lián)合干預(yù)48 h后SGC-7901細(xì)胞bax、bcl-2 mRNA檢測(cè) 采用RT-PCR法檢測(cè)。收集聯(lián)合組、SAL組、EGCG組、對(duì)照組處理48 h的細(xì)胞，分組情況與“1.4”相同，按照TRIzol試劑盒說明書操作提取總RNA，取2 μL進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。取擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，用凝膠全自動(dòng)成像系統(tǒng)拍照，以β-actin為內(nèi)參照，計(jì)算bax、bcl-2條帶灰度的比值。

2 結(jié)果

2.1 各組不同時(shí)點(diǎn)細(xì)胞增殖抑制率比較 結(jié)果見表1。

表1 各組不同時(shí)點(diǎn)細(xì)胞增殖抑制率比較

注：與對(duì)照組比較，※P<0.05；與同組上一濃度比較，#P<0.05；與同組前一時(shí)間點(diǎn)比較，△P<0.05。

2.2 各組細(xì)胞熒光染色情況比較 聯(lián)合組可見綠色熒光細(xì)胞數(shù)目減少，紅色熒光凋亡細(xì)胞和橘紅色死亡細(xì)胞明顯增多；單藥組可見細(xì)胞數(shù)減少，出現(xiàn)少量細(xì)胞核固縮的紅色熒光凋亡細(xì)胞和個(gè)別細(xì)胞核形態(tài)結(jié)構(gòu)正常的橘紅色死亡細(xì)胞；對(duì)照組細(xì)胞質(zhì)豐富，細(xì)胞核大小均一，呈綠色熒光(見圖1)。

注：A為對(duì)照組;B為SAL組;C為EGCG組;D為聯(lián)合組。

圖1SGC-7901細(xì)胞核染色結(jié)果(AO/EB熒光染色，×200)

2.3 各組細(xì)胞bax、bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 結(jié)果見表2。

表2 各組細(xì)胞bax、bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

注：與對(duì)照組比較，※P<0.05。

3 討論

胃癌是嚴(yán)重威脅我國(guó)人民健康的疾病之一，其較高的復(fù)發(fā)率仍是治療的難題。胃中分化腺癌的惡性程度比胃低分化腺癌低，但其病情發(fā)展較快，因此胃中分化腺癌的治療亦比較困難。早期胃中分化腺癌的治療以手術(shù)切除為主，中晚期胃中分化腺癌的治療主張多種方法綜合進(jìn)行?；熓沁M(jìn)展期胃癌的主要治療手段，主要采用細(xì)胞毒藥物聯(lián)合方案化療。目前，國(guó)際上無一致公認(rèn)的進(jìn)展期胃癌標(biāo)準(zhǔn)化療方案。因此，改善現(xiàn)有的用藥策略以及尋找更為有效的聯(lián)合化療方案是胃癌的重要研究方向。

羧基聚醚類型抗生素SAL不僅對(duì)胰腺癌[8]、乳腺癌[9]、白血病[10]等多種腫瘤干細(xì)胞有抑制作用，且不易出現(xiàn)耐藥性[11]，能夠增強(qiáng)17-AAG[12]、順鉑[13]、白藜蘆醇[14]等藥物抗腫瘤效應(yīng)。研究[15]證實(shí)，SAL具有抗癌作用，其作用機(jī)制的主要信號(hào)通路如下：①抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)靶基因表達(dá)；②增加Akt/PKB通路活性；③抑制mTOR信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)；④使細(xì)胞內(nèi)活性氧累積。EGCG抗腫瘤作用與促進(jìn)自噬、生長(zhǎng)抑制、周期停滯、誘導(dǎo)凋亡、抗血管生成、抑制侵襲等有關(guān)[16]。研究[17]發(fā)現(xiàn)，SAL能減少阿霉素、順鉑、氟尿嘧啶、吉西他濱、吉非替尼、長(zhǎng)春新堿等藥物的耐藥性。綠茶中的EGCG具有廣泛的積極生物活性，在心血管、癌癥、神經(jīng)退行性疾病、代謝綜合征和2型糖尿病等嚴(yán)重慢性疾病中均可發(fā)揮保護(hù)作用[18]。在抗癌方面，EGCG對(duì)非小細(xì)胞肺癌[19]、黑色素瘤[20]、胰腺癌[21]等惡性腫瘤中具有一定促凋亡、抑增殖效果。長(zhǎng)期單一使用化療藥易使腫瘤細(xì)胞對(duì)化學(xué)治療藥物敏感性降低，幾種藥物的聯(lián)合應(yīng)用可以克服腫瘤細(xì)胞對(duì)某一類藥物的耐藥。本研究顯示，SAL、EGCG單藥隨著藥物濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，均能呈劑量時(shí)間依賴性抑制SGC-7901細(xì)胞增殖，聯(lián)合用藥時(shí)抑制細(xì)胞增殖效果更顯著，聯(lián)合用藥時(shí)EGCG能減少SAL的用量，增強(qiáng)SGC-7901細(xì)胞對(duì)SAL敏感度；從熒光染色結(jié)果可見，對(duì)照組均為均勻綠色熒光、形態(tài)正常的細(xì)胞，在EGCG或SAL處理48 h后，SGC-7901細(xì)胞形態(tài)有改變，并出現(xiàn)少量紅色熒光凋亡細(xì)胞，在EGCG和SAL聯(lián)合48h后發(fā)現(xiàn)SGC-7901細(xì)胞減少，紅色熒光凋亡細(xì)胞比例更明顯，提示SAL、EGCG均能抑制SGC-7901細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)凋亡，兩者聯(lián)合效果更佳。

凋亡通過對(duì)一系列相關(guān)基因的激活、表達(dá)以及調(diào)控等作用，如bcl-2家族、caspase家族、癌基因、抑癌基因等，為更好地適應(yīng)生存環(huán)境，而在機(jī)體中散在的、逐個(gè)地從死亡和消失的一種細(xì)胞程序性死亡。bcl-2、bax是bcl-2家族中重要的凋亡調(diào)節(jié)因子。bcl-2抑制細(xì)胞凋亡與凋亡促進(jìn)基因bax相拮抗，共同決定細(xì)胞的凋亡[22]。Gao等[23]學(xué)者發(fā)現(xiàn)，SAL能通過上調(diào)凋亡基因bax、細(xì)胞色素C、凋亡肽酶激活因子1表達(dá)，下調(diào)bcl-2表達(dá)來調(diào)控凋亡。本研究顯示，聯(lián)合用藥可使SGC-7901細(xì)胞中bax表達(dá)升高，bcl-2表達(dá)下降，聯(lián)合用藥使兩種蛋白變化更明顯，提示SAL和EGCG聯(lián)合用藥可增強(qiáng)SGC-7901細(xì)胞凋亡的敏感性，其發(fā)生機(jī)制可能與下調(diào)bcl-2蛋白表達(dá)、上調(diào)bax蛋白表達(dá)有關(guān)。

總之，SAL、EGCG均能抑制SGC-7901細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)凋亡，兩者聯(lián)合效果更佳，其機(jī)制可能與降低bax表達(dá)及升高bcl-2表達(dá)有關(guān)。SAL與EGCG的聯(lián)合應(yīng)用可增強(qiáng)藥物的敏感性，可能是治療胃癌的一種有效的途徑。