李姝葉，畢小菁，王文軍

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，四川瀘州 646000)

肺癌是最常見(jiàn)的癌癥，也是癌癥死亡的主要原因，其中非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)約占肺癌總數(shù)的80%[1]。熊果酸(UA)是一種五環(huán)三萜類(lèi)化合物，廣泛存在于自然植物的莖皮、葉和果皮中，具有抗炎、抗氧化、抗血管生成及抗腫瘤等作用[2]。有研究[3]表明，UA可以調(diào)控腫瘤細(xì)胞的相關(guān)基因表達(dá)及調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的信號(hào)通路，從而產(chǎn)生抗腫瘤作用。Huang等[4]發(fā)現(xiàn)，UA可以明顯抑制肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。miRNA是一類(lèi)非編碼的小分子RNA，可以在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因的表達(dá)，降解靶基因或抑制其翻譯，從而影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[5]。目前，有關(guān)UA抑制人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549的增殖、遷移、侵襲的作用機(jī)制尚不明確，且UA是否通過(guò)作用于miRNA從而抑制A549細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲的相關(guān)研究甚少。2017年10月～2018年8月，我們觀察了UA對(duì)A549細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力的影響，并探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 UA購(gòu)自Sigma公司；A549細(xì)胞來(lái)源于西南醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室；miRNA-21 inhibitor、miRNA-21 mimic(RiboBio公司)；RPMI1640培養(yǎng)液(Hyclone公司)，新生小牛血清(四季青公司)，脂質(zhì)體Lipofectamine2000、TRIzol試劑(Invitrogen公司)，CCK-8檢測(cè)試劑盒(碧云天公司)，Transwell板、Matrigel膠(美國(guó)Corning公司)，RT-PCR試劑盒(大連TaKaRa公司)，PCR引物(武漢金開(kāi)瑞公司)，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(ASPEN公司)，抗GAPDH抗體、抗PTEN抗體及抗PI3K抗體(美國(guó)Abcam公司)，抗AKT抗體(美國(guó)CST公司)。

1.2 UA的IC50值計(jì)算及A549細(xì)胞中異常表達(dá)miRNA篩選 ①將A549細(xì)胞置入含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用胰蛋白酶消化，配制成濃度為1×105/mL的細(xì)胞懸液接種于96孔板，每孔加100 μL，置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。分別加入0、5、10、20、30、40、50 μmol/L的UA，分別設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24 h，所有孔中加入10 μL的CCK-8，于培養(yǎng)箱中孵育2 h，去除培養(yǎng)基，加入100 μL溶液，使用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的OD值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。UA作用于A549細(xì)胞24 h后，UA的IC50值為42 μmol/L。②取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞5×107個(gè)，接種于培養(yǎng)基24 h，待細(xì)胞貼壁后加入42 μmol/L的UA繼續(xù)培養(yǎng)24 h，同時(shí)選擇不加UA的為對(duì)照；采用miRNeasy Mini Kit對(duì)兩組細(xì)胞進(jìn)行total RNA抽提，抽提所得total RNA經(jīng)Agilent Bioanalyzer 2100電泳質(zhì)檢合格后備用，采用miRNA Complete Labeling and Hyb Kit對(duì)樣品中的miRNA分子進(jìn)行熒光標(biāo)記及芯片雜交，芯片結(jié)果采用Agilent Microarray Scanner進(jìn)行掃描，用Feature Extraction software 10.7.1.1讀取數(shù)據(jù)，最后采用AgiMicroRna進(jìn)行歸一化處理，miRNA 芯片檢測(cè)由上海伯豪生物技術(shù)有限公司完成。結(jié)果分析將改變大于2倍作為篩選異常表達(dá)miRNA的選擇依據(jù)。UA誘導(dǎo)前后A549細(xì)胞中有34條表達(dá)改變大于2倍的miRNA，其中上調(diào)的miRNA有20條，下調(diào)的miRNA有14條，結(jié)合檢出miRNA信號(hào)值及改變倍數(shù)綜合考慮篩選miRNA-21做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 轉(zhuǎn)染后A549細(xì)胞miR-21檢測(cè) 采用PCR法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞并分為4組，a組轉(zhuǎn)染miR-21 inhibitor，b組轉(zhuǎn)染miR-21 mimic，c組轉(zhuǎn)染miR-NC，d組不干預(yù)。根據(jù)脂質(zhì)體Lipo 2000的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行細(xì)胞的轉(zhuǎn)染，分別用25 μL Opti-MEM無(wú)血清培養(yǎng)基將脂質(zhì)體Lipo 2000、miR-21 inhibitor、miR-21 mimic及miR-NC稀釋，室溫孵育5 min后混勻，室溫放置20 min。加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染6 h后，細(xì)胞換完全培養(yǎng)基，繼續(xù)于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后，采用TRIzol法按照說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再按照熒光定量PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行擴(kuò)增，按以下擴(kuò)增程序反應(yīng)：預(yù)變性、擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)、分析熔解曲線，每個(gè)樣品均作3個(gè)復(fù)孔。以U6為內(nèi)參照，以2-ΔΔCt代表目的基因的表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。a、b、c、d組miR-21相對(duì)表達(dá)量分別為0.35±0.07、2.18±0.12、1.04±0.07、0.96±0.10，a、b組分別與c、d組比較，P均<0.05，證明轉(zhuǎn)染成功。

1.4 UA對(duì)A549細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力的影響觀察 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞并分為A、B、C、D組，A、B組細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR-21 inhibitor及miR-21 mimic，24 h后除D組外其余各組均加入42 μmol/L UA繼續(xù)培養(yǎng)并進(jìn)行下述實(shí)驗(yàn)：①細(xì)胞增殖能力：上述4組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后采用CCK-8法檢測(cè)。使用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm光吸收值，計(jì)算細(xì)胞增殖率，細(xì)胞增殖率=(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值)/(對(duì)照組OD值-空白組OD值)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。②細(xì)胞遷移能力：上述4組細(xì)胞接種于6孔板中(每孔約5×105個(gè))，用無(wú)菌槍頭在孔內(nèi)劃5條平行線，PBS輕輕漂洗3次后加入培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)，剛加入42 μmol/L UA時(shí)顯微鏡下拍照，記為0 h，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，拍照記為24 h。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。③細(xì)胞侵襲能力：采用Transwell實(shí)驗(yàn)。將matrigel和培養(yǎng)基以1∶3的比例稀釋，取50 μL加入Transwell小室中干燥備用。分別取200 μL(105個(gè)/mL)上述4組細(xì)胞懸液放入Transwell小室中。將小室放入含培養(yǎng)基的24孔板中置于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)48 h，將小室取出，用棉簽將上室中的膠和細(xì)胞擦除干凈，結(jié)晶紫染色10 min，洗去表面的結(jié)晶紫，于倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)遷移至微孔膜下層的細(xì)胞數(shù)，拍照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.5 UA對(duì)A549細(xì)胞PTEN、PI3K、AKT表達(dá)的影響觀察 ①PTEN、PI3K、AKT mRNA：采用熒光定量PCR法檢測(cè)。收集“1.4”中4組細(xì)胞，采用“1.3”中熒光定量PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞PTEN、PI3K、AKT mRNA。②PTEN、PI3K、AKT蛋白：采用Western blotting法。收集“1.4”中4組細(xì)胞，按照細(xì)胞總蛋白提取試劑盒步驟提取細(xì)胞蛋白，采用BCA蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定樣品蛋白濃度。根據(jù)測(cè)得濃度取相應(yīng)體積樣品至每孔40 μg蛋白，100 ℃沸水浴5 min，按濃縮膠80 V、分離膠120 V進(jìn)行恒壓電泳，按300 mA恒流轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜時(shí)間根據(jù)目的蛋白分子量大小調(diào)整。將轉(zhuǎn)好的膜加入封閉液室溫封閉1 h。加入已稀釋好的一抗4 ℃過(guò)夜，用TBST洗3次，加入稀釋好的二抗，室溫孵育30 min，ECL發(fā)光并拍照。將膠片進(jìn)行掃描存檔，AlphaEaseFC軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的光密度值。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞增殖率、24 h劃痕相對(duì)寬度、穿膜個(gè)數(shù)比較 細(xì)胞增殖率、24 h劃痕相對(duì)寬度、穿膜個(gè)數(shù)比較見(jiàn)表1。

表1 各組細(xì)胞增殖率、24 h劃痕相對(duì)寬度、穿膜個(gè)數(shù)比較

注：與C組比較，*P<0.05。

2.2 各組細(xì)胞PTEN、PI3K、AKT蛋白和mRNA比較 細(xì)胞PTEN、PI3K、AKT蛋白和mRNA比較見(jiàn)表2。

3 討論

肺癌是當(dāng)今世界最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，據(jù)美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)統(tǒng)計(jì)，最常見(jiàn)的癌癥死亡原因是肺癌，肺癌按組織病理學(xué)可分為NSCLC和小細(xì)胞肺癌，其中NSCLC約占80%，主要包括腺癌、鱗狀上皮細(xì)胞癌、大細(xì)胞癌以及一些發(fā)病率較低的肺癌[6]。手術(shù)、化療、放療、分子靶向治療、免疫治療、中藥治療是目前臨床上治療NSCLC的主要方法，但因?yàn)榇蟛糠只颊叽_診時(shí)已處于病程中晚期，喪失了最佳的手術(shù)時(shí)機(jī),且化療藥不良反應(yīng)大，故NSCLC患者的5年生存率也只有大約65%[7,8]。A549細(xì)胞為NSCLC的主要類(lèi)型，因此尋找能夠抑制A549細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡的新方法具有重大意義。

表2 各組細(xì)胞PTEN、PI3K、AKT蛋白和mRNA比較

注：與C組比較，*P<0.05。

UA是一種五環(huán)三萜類(lèi)化合物，具有抗炎、抗氧化、肝保護(hù)、抗血管、抗腫瘤生成等作用[9～12]。UA有抗腫瘤作用，可用于乳腺癌、白血病、前列腺癌、黑色素瘤、子宮內(nèi)膜癌、肺癌等治療中[13]。Hsu等[14]研究表明，UA可以抑制肺癌A549細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡，是最有前途的抗肺癌藥物之一。本研究顯示，UA能抑制肺癌A549細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。

眾所周知，miRNA-21通過(guò)調(diào)控細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、血管生成、抗凋亡等多種分子機(jī)制，在腫瘤發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[15]。各種研究都觀察到miRNA-21在肺癌患者中的表達(dá)異常[16]。PI3K/AKT信號(hào)通路在控制細(xì)胞存活、促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡等方面具有重要作用[17]。PTEN是目前已知的第一種抑制腫瘤活性的磷酸酶[18]。PTEN/PI3K/AKT信號(hào)通路是包括骨肉瘤在內(nèi)的許多實(shí)體癌發(fā)生過(guò)程中的主要調(diào)控因子，PTEN/PI3K/AKT蛋白已被發(fā)現(xiàn)在多種癌癥中異常表達(dá)[19,20]。Li等[21]發(fā)現(xiàn)，miR-21通過(guò)下調(diào)PTEN以及激活PI3K/AKT通路參與EGFR-TKI在NSCLC中的獲得性耐藥。Zhang等[22]認(rèn)為,下調(diào)miR-21的表達(dá)后，腫瘤抑制因子PTEN表達(dá)增加，抑制了NSCLC的增殖和侵襲。故可以猜想miRNA-21調(diào)控細(xì)胞的作用可能與PTEN/PI3K/AKT信號(hào)通路有關(guān)。

UA可以通過(guò)上調(diào)或者下調(diào)miRNA的表達(dá)從而調(diào)控細(xì)胞功能，Lu等[23]發(fā)現(xiàn)UA通過(guò)抑制miRNA-21/PTEN/Akt/mTOR途徑上調(diào)自噬，減輕糖尿病系膜細(xì)胞損傷。Jiang等[24]報(bào)道UA誘導(dǎo)大鼠原發(fā)性血管平滑肌細(xì)胞的抗增殖作用與抑制miRNA-21后引發(fā)PTEN/PI3K的變化有關(guān)。Wu等[25]研究表明，UA通過(guò)上調(diào)PTEN基因表達(dá)和PI3K/Akt通路失活從而誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡。本研究顯示，UA作用下肺癌A549細(xì)胞miR-21相對(duì)表達(dá)量下降，PTEN表達(dá)升高，PI3K、AKT表達(dá)降低，由此我們可以猜測(cè)，UA能抑制肺癌A549細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的作用機(jī)制可能是通過(guò)下調(diào)miRNA-21作用于PTEN/PI3K/AKT通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的。為了驗(yàn)證我們的猜測(cè)，我們?cè)诜伟〢549細(xì)胞中轉(zhuǎn)染了miRNA-21 inhibitor，轉(zhuǎn)染成功后肺癌A549細(xì)胞的miRNA-21 表達(dá)明顯下降，在下調(diào)miRNA-21表達(dá)后，UA抑制A549細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲作用增強(qiáng)，PTEN的表達(dá)增加，并且抑制了PI3K/AKT的表達(dá)，而轉(zhuǎn)染miRNA-21 mimic后的肺癌A549細(xì)胞的miRNA-21 表達(dá)明顯增多，在上調(diào)miRNA-21表達(dá)后，UA抑制A549細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲作用減弱，PTEN的表達(dá)減少，PI3K/AKT表達(dá)增加。

總之，UA能抑制肺癌A549細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，其作用機(jī)制可能是通過(guò)下調(diào)miRNA-21作用于PTEN/PI3K/AKT通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的，這為以后UA的基礎(chǔ)研究、臨床研究及應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。