王純斌，袁琳，王梅娟，沈福軍，黎超，趙明宏

(1東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鹽城醫(yī)院，江蘇鹽城 224001；2鹽城市第三人民醫(yī)院；3南通大學(xué)附屬建湖醫(yī)院；4建湖縣人民醫(yī)院)

肺癌是最常見的惡性腫瘤，位居全球癌癥相關(guān)死亡原因的第一位[1]。肺癌根據(jù)病理組織類型和臨床特征可分為非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)和小細(xì)胞肺癌(SCLC)，其中NSCLC占80%左右[2]。目前，雖然許多分子靶點(diǎn)已經(jīng)明確可以改善NSCLC的治療療效，但患者5年總生存率仍為16%[3]。NSCLC靶向藥物耐藥、轉(zhuǎn)移及進(jìn)展的主要原因是肺癌分子改變的異質(zhì)性[4]，因此進(jìn)一步尋找肺癌發(fā)生發(fā)展新的分子機(jī)制，對(duì)提高NSCLC患者的治療及改善生存質(zhì)量具有重要意義。微小RNA(microRNA)是一類非編碼單鏈小分子RNA，長度19～25個(gè)核苷酸，其通過與靶基因mRNA的3′非翻譯區(qū)結(jié)合調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)水平[5]，在癌癥細(xì)胞增殖、侵襲、遷移、凋亡等生物過程中起關(guān)鍵作用[6]。研究[7]顯示，miRNA在NSCLC中表達(dá)異常，并可作為癌癥生物標(biāo)志物和藥物靶點(diǎn)。文獻(xiàn)[8,9]報(bào)道，miR-194在肺癌組織中低表達(dá)與患者生存期短顯著相關(guān)，且低表達(dá)的miR-194通過靶向hNUDC促進(jìn)NSCLC細(xì)胞95C和95D的增殖參與肺癌的發(fā)生，但miR-194在NSCLC細(xì)胞中的凋亡作用及機(jī)制目前研究涉及較少。2017年1月～2018年6月，本研究觀察了miR-194對(duì)人NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549增殖、克隆形成、凋亡能力的影響，并探討其可能機(jī)制，旨在為開發(fā)NSCLC基因治療新靶標(biāo)提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、miR-194抑制物、miR-194模擬物及主要試劑 A549細(xì)胞、人肺正常上皮細(xì)胞16HBE均購自美國ATCC細(xì)胞庫；miR-194抑制物、miR-194 mimics、內(nèi)參GAPDH的引物由上海捷瑞生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成；RPMI1640培養(yǎng)基、DMEM-F12培養(yǎng)基、FBS購自美國Gibco公司，MTS細(xì)胞增殖檢測、細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、蛋白裂解試劑購自南京凱基生物技術(shù)有限公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)試劑盒均購自日本TaKaRa公司，脂質(zhì)體2000、TRIzol均購自美國Invitrogen公司，兔抗人JAK2(ab108596)、pSTAT3(ab76315)、兔抗人活化的Caspase-3抗體(ab2302)、鼠抗人GAPDH抗體(ab8245)、BCA試劑盒購自美國Thermo公司。

1.2 A549、16HBE細(xì)胞中miR-194檢測 將A549細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)基中，16HBE細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1460培養(yǎng)基中，放置37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。采用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，Nanodrop 2000鑒定總RNA符合實(shí)驗(yàn)要求，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA作為模板進(jìn)行熒光定量PCR，反應(yīng)條件：94 ℃、2 min，94 ℃、20 s，60 ℃、30 s，共40個(gè)循環(huán)。miR-194引物序列：5′-CATT-CAACGCTGTCGGTGAGT-3′，5′-GCTGTCAACGATACGC-TACGTAACG-3′，GAPDH引物序列：5′-TGACCTCAACTACATGGTCTACA-3′，5′-CTTCCCATTCTCGGCCTTG-3′。以GAPDH作為內(nèi)參基因，以2-ΔΔCt代表目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 miR-194抑制物、模擬物轉(zhuǎn)染及細(xì)胞分組 A549細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)基中，放置37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前24 h，將呈對(duì)數(shù)生長且生長情況良好的細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞板，細(xì)胞融合度達(dá)80%時(shí)按照試劑說明書，采用脂質(zhì)體2000將miR-194抑制物、miR-194模擬物、對(duì)照分別轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中(分別計(jì)為A、B、C組)。轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 轉(zhuǎn)染后的A549細(xì)胞miR-194檢測方法 取轉(zhuǎn)染48 h后的各組細(xì)胞，用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，Nanodrop 2000鑒定總RNA符合實(shí)驗(yàn)要求，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA作為模板進(jìn)行熒光定量PCR，反應(yīng)條件：94 ℃、2 min，94 ℃、20 s，60 ℃、30 s，共40個(gè)循環(huán)。miR-194引物序列：5′-CATTCAACGCTGTCGGTGAGT-3′，5′-GCTGTCAACGATACGCTAC GTAACG-3′，GAPDH引物序列：5′-TGACCTCAACTACATGGTCTACA -3′，5′-CTTCCCATTCTCGGCCTTG-3′。以GAPDH作為內(nèi)參基因，應(yīng)用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-194相對(duì)表達(dá)水平。

1.5 轉(zhuǎn)染后的A549細(xì)胞增殖能力檢測 取轉(zhuǎn)染48 h后的各組細(xì)胞，以每孔2 000個(gè)細(xì)胞、150 μL培養(yǎng)基接種于96孔板中，每組設(shè)6個(gè)平行復(fù)孔，放至培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在鋪板后第0、24、48、72 h各孔加入30 μL的MTS工作液，培養(yǎng)箱中孵育2 h后，掃描酶標(biāo)儀490 nm波長處測取OD值，OD值越高提示存活細(xì)胞數(shù)越多，細(xì)胞相對(duì)增殖能力越強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.6 轉(zhuǎn)染后的A549細(xì)胞克隆形成能力檢測 取轉(zhuǎn)染48 h后的各組細(xì)胞，以每孔300個(gè)細(xì)胞、2 mL培養(yǎng)基接種于6孔板中，每組設(shè)3個(gè)平行復(fù)孔，放至培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)1周時(shí)，各組轉(zhuǎn)染試劑重復(fù)加入各組孔中1次，繼續(xù)培養(yǎng)1周，肉眼觀察到克隆團(tuán)時(shí)，棄掉培養(yǎng)基，PBS洗3次，1 mL甲醇固定15 min，晾干后加入1 mL蘇木素染色30 min，雙蒸水沖洗后晾干，掃描拍照，計(jì)數(shù)肉眼可見克隆數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.7 轉(zhuǎn)染后的A549細(xì)胞凋亡能力檢測 ①Hoechst 33342染色：取轉(zhuǎn)染48 h及1 mmol的H2O2處理12 h后的各組細(xì)胞，以每孔1×106個(gè)細(xì)胞、2 mL培養(yǎng)基接種于6孔板中，每組設(shè)3個(gè)平行復(fù)孔，放至培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棄掉培養(yǎng)基，PBS小心洗3次，1 mL的4%多聚甲醛固定30 min。PBS小心洗3次，用Hoechst 33342染色液室溫下避光孵育30 min，PBS小心洗3次。封片后倒置熒光顯微鏡觀察藍(lán)色的細(xì)胞核形態(tài)。②流式細(xì)胞儀：用無EDTA的胰酶收集轉(zhuǎn)染48 h及1 mmol的H2O2處理12 h后的各組細(xì)胞，每管1×106個(gè)細(xì)胞，PBS洗3次后，加入500 μL的染色工作液(500 μL Binding Buffer，5 μL Annexin V-APC，5 μL 7-ADD染液)，混勻后避光室溫孵育15 min。PBS洗1次后，流式細(xì)胞儀檢測凋亡細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.8 轉(zhuǎn)染后的A549細(xì)胞JAK2、pSTAT3、活化的Caspase-3蛋白檢測 收集轉(zhuǎn)染48 h及1 mmol的H2O2處理12 h后的各組細(xì)胞，每孔加入500 μL的蛋白裂解液(含有5 μL的蛋白酶抑制劑和5 μL的磷酸酶抑制劑)，超聲裂解30 min，在4 ℃條件下以12 000 r/min離心30 min，將上清轉(zhuǎn)移至新的EP管中，BCA試劑盒測蛋白濃度，煮沸變性后，每孔50 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，經(jīng)濕轉(zhuǎn)將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，8%脫脂牛奶封閉3 h，加入GAPDH和JAK2、pSTAT3、活化的Caspase-3一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗3次后，二抗孵育室溫孵育2 h，ELC化學(xué)發(fā)光法曝光條帶，掃描拍照。蛋白條帶灰度值采用Quantity One V4軟件進(jìn)行分析。結(jié)果重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 A549、16HBE細(xì)胞中miR-194相對(duì)表達(dá)量比較 A549、16HBE細(xì)胞中miR-194相對(duì)表達(dá)量分別為1.00±0.10、8.17±0.14，兩者比較，P<0.05。

2.2 各組細(xì)胞miR-194相對(duì)表達(dá)量比較 A、B、C組miR-194相對(duì)表達(dá)量分別為0.31±0.11、8.35±0.31、1.00±0.10，A、B組分別與C組比較，P均<0.05。

2.3 各組細(xì)胞增殖能力比較 各組細(xì)胞不同時(shí)點(diǎn)OD值比較見表1。

表1 各組細(xì)胞不同時(shí)點(diǎn)OD值比較

注：與C組比較，*P<0.05。

2.4 各組細(xì)胞克隆能力比較 A、B、C組細(xì)胞克隆數(shù)目分別為(232.12±10.82)、(43.67±10.97)、(127.33±6.43)個(gè)，A、B組分別與C組比較，P均<0.05。

2.5 各組細(xì)胞凋亡能力比較 ①Hoechst 33342染色結(jié)果：與C組比較，A組細(xì)胞凋亡現(xiàn)象及數(shù)目明顯減少，B組細(xì)胞凋亡現(xiàn)象及數(shù)目明顯增多。②流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果：A、B、C組細(xì)胞凋亡率分別為4.58%±1.01%、21.45%±1.78%、10.23%±1.65%，A、B組分別與C組比較，P均<0.05。

2.6 各組細(xì)胞JAK2、pSTAT3、活化的Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 結(jié)果見表2。

表2 各組細(xì)胞JAK2、pSTAT3、活化的Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

注：與C組比較，*P<0.05。

3 討論

NSCLC是最常見的惡性程度較高的腫瘤，嚴(yán)重威脅人們的生命健康[10]。目前，NSCLC的治療手段包括手術(shù)、放化療、分子靶向和生物治療，隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，治療雖然有一定的療效，但發(fā)病率和病死率仍居高不下[11,12]。NSCLC的發(fā)病機(jī)制至今尚未闡明，研究在NSCLC發(fā)病過程中起作用的關(guān)鍵因子，可能為治療提供新的靶標(biāo)，以降低患者病死率和改善患者預(yù)后。A549細(xì)胞源自一名58歲的白人男性，是1972年由GiardDJ通過肺癌組織移植培養(yǎng)建系的，被研究者廣泛應(yīng)用。

越來越多的miRNAs在腫瘤中表達(dá)失調(diào)及發(fā)揮的作用逐步被挖掘[13]，miRNAs是一類高度保守的小分子單鏈RNA，其不能編碼蛋白質(zhì)，但可以通過調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄影響蛋白的表達(dá)，同時(shí)還可以調(diào)控多條腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)信號(hào)通路[14,15]，因此miRNAs在腫瘤的發(fā)生和惡性進(jìn)展中具有重要作用。此外，在腫瘤中表達(dá)失調(diào)的miRNAs具有癌基因和抑癌基因的功能，可以作為治療腫瘤的藥物靶點(diǎn)[16]。最近在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)miR-194表達(dá)失調(diào)，其在胃腸消化系統(tǒng)中特異性表達(dá)。miR-194是首先通過抑制肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移而被鑒定為小鼠肝上皮細(xì)胞中的抑制基因[17]，同樣在卵巢癌和黑色素瘤中檢測到miR-194低表達(dá)[18,19]，miR-194通過靶向KDM5B抑制食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖和侵襲，誘導(dǎo)凋亡[20]。研究[8]表明，miR-194在NSCLC中下調(diào)，并且表達(dá)水平降低與患者預(yù)后差密切相關(guān)，但miR-194的低表達(dá)與NSCLC凋亡的關(guān)系尚不清楚。本研究顯示，miR-194在A549細(xì)胞中表達(dá)低于16HBE細(xì)胞，與已有的研究一致；A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-194抑制物后miR-194表達(dá)降低，細(xì)胞增殖能力和平板克隆形成能力升高，H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡減少；A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-194 mimics后miR-194表達(dá)升高，細(xì)胞增殖能力和平板克隆形成能力降低，H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡增多。

細(xì)胞凋亡是生命活動(dòng)的正?，F(xiàn)象，細(xì)胞功能受損及衰老時(shí)凋亡程序啟動(dòng)，以維持機(jī)體內(nèi)穩(wěn)態(tài)，細(xì)胞凋亡程序的啟動(dòng)是一個(gè)嚴(yán)格有序的過程，Caspase蛋白的改變是細(xì)胞凋亡發(fā)生的重要標(biāo)志，而Caspase-3是以無活性的前體存在，在細(xì)胞接受到一系列的凋亡信號(hào)后Caspase-3經(jīng)過剪切成為活化的執(zhí)行因子Caspase-3，其是細(xì)胞凋亡不可逆的標(biāo)志[21]。本研究顯示，A組活化Caspase-3蛋白表達(dá)減少，B組表達(dá)增多，提示細(xì)胞中miR-194可以作用于凋亡蛋白Caspase-3促進(jìn)細(xì)胞凋亡。而細(xì)胞凋亡受一系列基因的共同調(diào)控，JAK/STAT3信號(hào)通路是近年發(fā)現(xiàn)的一條參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及免疫調(diào)節(jié)等許多重要的生物學(xué)過程的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[22,23]。JAK/STAT3信號(hào)通路在正常生命活動(dòng)中受到嚴(yán)密的調(diào)控，JAK激活后使受體上的酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化而結(jié)合STAT3，引起STAT3的過度活化，其由失活狀態(tài)轉(zhuǎn)為磷酸化狀態(tài)(pSTAT3)，pSTAT3作為一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，通過特異性結(jié)合DNA調(diào)節(jié)抗凋亡靶基因轉(zhuǎn)錄發(fā)揮抗凋亡功能[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，A組JAK2、pSTAT3蛋白表達(dá)降低，B組升高；李雷雷等[25]利用JAK2/STAT3特異性阻斷劑AG490阻斷JAK2/STAT3通路，發(fā)現(xiàn)活化Caspase-3蛋白表達(dá)增多。由此我們確定，miR-194抑制NSCLC細(xì)胞的JAK2/STAT3信號(hào)通路以促進(jìn)NSCLC細(xì)胞凋亡。

總之，miR-194通過抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路作用于Caspase-3蛋白誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞的凋亡，是細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡的潛在靶點(diǎn)，可以為干預(yù)和防治NSCLC提供新的思路。