劉力，范文芳，賀曉旭，鄧祖亮，何松，彭釗，王文婷

(1湘南學(xué)院附屬醫(yī)院，湖南郴州 423000；2湘南學(xué)院附屬醫(yī)院)

原發(fā)性肝癌(HCC)是我國(guó)常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，每年可明確診斷的病例約40萬(wàn)人，達(dá)到全球范圍新確診病例的50%左右，病死率在全球高達(dá)第2位，每年死亡人數(shù)超過(guò)30萬(wàn)[1]。研究[2,3]發(fā)現(xiàn)，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)被認(rèn)為是腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制之一，并被證實(shí)逆轉(zhuǎn)EMT可顯著降低腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移能力。課題組前期研究證實(shí)，人肝癌細(xì)胞系HepG2使用生長(zhǎng)抑素干預(yù)后可逆轉(zhuǎn)EMT發(fā)生，從而降低肝癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力[4]。二甲雙胍(Met)是治療2型糖尿病的一線用藥，能顯著降低2型糖尿病合并肝癌等腫瘤發(fā)病的概率[5]，具有多種抗腫瘤作用，包括抑制LKB1-AMPK-mTOR途徑、誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯及降低循環(huán)中胰島素、IGFs水平和抑制腫瘤新生血管的生成、炎癥反應(yīng)、氧自由基的生成、腫瘤干細(xì)胞增殖等。EMT作為腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制，與Met之間的關(guān)系在國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道。本研究觀察了Met對(duì)HepG2細(xì)胞增殖、遷移能力的影響，并探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌細(xì)胞系HepG2購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物所；鹽酸二甲雙胍購(gòu)自貴州圣濟(jì)堂制藥有限公司；DMEM培養(yǎng)基、RPMI1640購(gòu)自Hyclone公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)購(gòu)自Bioswamp公司；胎牛血清、F12 K購(gòu)自Gibco公司；胰蛋白酶及PBS購(gòu)自Bioswamp公司；Protein G Magnetic Beads購(gòu)自Cell Signaling公司；Transwell系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Corning公司；蛋白質(zhì)Marker購(gòu)自Thermo公司；十二烷基硫酸鈉(SDS)、TEMED、過(guò)硫酸胺購(gòu)自Sigma公司；PVDF轉(zhuǎn)移膜、化學(xué)發(fā)光試劑購(gòu)自Millipore公司；Tween-20購(gòu)自Amresco公司；RIPA(強(qiáng))組織細(xì)胞快速裂解液、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒(增強(qiáng)型)、PBS磷酸鹽緩沖液購(gòu)自Bioswamp公司；兔抗人E-cadherin、Vimentin抗體購(gòu)自Bioswamp公司。

1.2 HepG2細(xì)胞培養(yǎng)、分組及二甲雙胍的應(yīng)用 將凍存的HepG2細(xì)胞從液氮罐中取出，置于DMEM培養(yǎng)基中(內(nèi)含10%FBS+100 U/mL青-鏈霉素)，于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，等待細(xì)胞生長(zhǎng)，達(dá)到80%融合時(shí)進(jìn)行傳代。提取傳6代的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞使用0.25%胰蛋白酶消化，配制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度至1×104/mL，以每孔100 μL接種于96孔板中培養(yǎng)24 h。將細(xì)胞分為A、B、C、D、E組，各組設(shè)6個(gè)平行孔，A、B、C、D組分別加入1、5、10、50 mmol/L的二甲雙胍各200 μL，E組給予等體積培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.3 HepG2細(xì)胞增殖能力觀察 采用MTT法。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，分于96孔板，每孔180 μL，每種細(xì)胞每塊板接種3個(gè)同樣的孔作為復(fù)孔，1×103～5×103個(gè)細(xì)胞/孔，以200 μL培養(yǎng)液做空白對(duì)照，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜；各組藥物處理后繼續(xù)培養(yǎng)48 h；取出不同分組的細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加20 μL的MTT溶液(5 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；吸掉上清，每孔加入150 μL的DMSO溶解液，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490 nm處測(cè)量各孔的吸光值(OD值)，計(jì)算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率=試驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值×100%(A、B、C、D組為試驗(yàn)組，E組為對(duì)照組)。

1.4 HepG2細(xì)胞遷移能力觀察 采用Transwell小室法。選取100 μL單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104/mL，予以接種于Transwell上室中，各組藥物處理后在Transwell下室加入DMEM高糖培養(yǎng)基(含10%FBS)600 μL。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后倒置小室將濾膜下表面朝上，4%多聚甲醛固定(室溫，15 min)，0.1%結(jié)晶紫染色(15 min)，進(jìn)行封片。在200倍顯微鏡下，隨機(jī)取5個(gè)不同視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，穿過(guò)濾膜的細(xì)胞數(shù)即為跨膜細(xì)胞數(shù)，每組平行設(shè)3個(gè)濾膜。

1.5 HepG2細(xì)胞E-cadherin、Vimentin檢測(cè) 采用Western blotting法。各組藥物處理48 h后，分別提取各組細(xì)胞總蛋白，各蛋白定量采用BCA法進(jìn)行。取40 μg蛋白進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜，使用5%BSA溶液封閉2 h，一抗在4 ℃環(huán)境中孵育過(guò)夜：E-cadherin(1∶1 000)、Vimentin(1∶1 000)、β-actin(1∶500)，TBST洗膜10 min，共4次；相應(yīng)二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜10 min，同樣為4次。加入ECL發(fā)光劑，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)自動(dòng)提取結(jié)果，計(jì)算兩種蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞存活率、跨膜細(xì)胞數(shù)比較 結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各組細(xì)胞存活率、跨膜細(xì)胞數(shù)比較

注：與E組比較，*P<0.05；與A組比較，#P<0.05；與B組比較，☆P<0.05；與C組比較，ΔP<0.05。

2.2 各組E-cadherin、Vimentin相對(duì)表達(dá)量比較 結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各組E-cadherin、Vimentin相對(duì)表達(dá)量比較

注：與E組比較，*P<0.05；與A組比較，#P<0.05；與B組比較，☆P<0.05；與C組比較，ΔP<0.05。

3 討論

我國(guó)原發(fā)性肝癌發(fā)病率高，每年新發(fā)病例約占全球病例總數(shù)的50%[6]，且有逐年升高趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅人們身體健康和生命安全，因此肝癌的防治是現(xiàn)今社會(huì)非常重要的任務(wù)。隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展及國(guó)民經(jīng)濟(jì)的增長(zhǎng)，以外科手術(shù)為主的治療模式已逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榻Y(jié)合放化療、射頻、微波消融、TACE、靶向、免疫等多種治療手段的綜合治療模式[7]。使肝癌患者接受了更加規(guī)范化、綜合性的治療，預(yù)后也逐步改善，但仍有50%以上的患者在治療5年內(nèi)出現(xiàn)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，是肝癌患者治療失敗和死亡的主要原因。如何有效地預(yù)防及治療復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，是改善肝癌患者遠(yuǎn)期療效的關(guān)鍵，也是目前研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。

大量臨床流行病學(xué)研究[8,9]發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病患者原發(fā)性肝癌的發(fā)病率顯著增高。Met為治療2型糖尿病的常用藥物，報(bào)道稱其具有潛在抗肝癌作用。研究[10,11]顯示，2型糖尿病合并肝癌患者長(zhǎng)期口服Met后能抑制肝癌細(xì)胞的增殖，起到降低肝癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。Met抗肝癌的機(jī)制主要有以下幾方面：①抑制LKB1-AMPK-mTOR 途徑[12,13]；②誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯[14,15]；③降低循環(huán)中胰島素、IGFs的水平[16]；④抑制腫瘤新生血管的生成和炎癥反應(yīng)[17,18]；⑤抑制氧自由基的生成[19]；⑥抑制腫瘤干細(xì)胞增殖[20]。EMT是指在某些因素作用下，上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)橛虚g質(zhì)細(xì)胞表型的過(guò)程[21]。改變腫瘤細(xì)胞的連接及極性，使得腫瘤細(xì)胞間黏附性減弱、運(yùn)動(dòng)性增強(qiáng)，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移，并被認(rèn)為其重要機(jī)制之一[22]。在原發(fā)性肝癌的病理生理進(jìn)程中起非常重要的作用，發(fā)生EMT可以促進(jìn)肝纖維化及癌變發(fā)展，并且是促進(jìn)轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素。由于人肝癌細(xì)胞系HepG2組織類型為肝母細(xì)胞瘤，適合用于肝細(xì)胞代謝方面的研究，故本實(shí)驗(yàn)選擇該細(xì)胞。在MTT實(shí)驗(yàn)中，隨著Met濃度增加，細(xì)胞存活率降低；而在Transwell小室法實(shí)驗(yàn)中可見(jiàn)，隨著Met濃度增加，跨膜細(xì)胞數(shù)越少；通過(guò)這兩部分實(shí)驗(yàn)可以表明Met能抑制肝癌細(xì)胞增殖及遷移能力，且呈濃度依賴性。

為明確Met與肝癌細(xì)胞EMT之間的關(guān)系，本研究檢測(cè)了藥物干預(yù)后細(xì)胞內(nèi)重要蛋白的表達(dá)，包括EMT代表性上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin及間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Vimentin。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各藥物組E-cadherin表達(dá)量均高于E組，且隨著Met濃度升高其表達(dá)量升高；而Vimentin表達(dá)量降低，同樣與濃度呈依賴性?？梢缘弥琈et具有逆轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞EMT的作用，并且與Met的濃度有關(guān)。這也為Met能抑制肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力提供了一個(gè)理論基礎(chǔ)。但腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程為多因素、多過(guò)程及多環(huán)節(jié)，其具體的機(jī)制還有待研究。

總之，不同濃度Met均能抑制人肝癌細(xì)胞系HepG2的侵襲及轉(zhuǎn)移，且呈濃度依賴性，其機(jī)制可能為逆轉(zhuǎn)EMT的發(fā)生有關(guān)。