殷新光，薛文英，徐英，吳一鳴，袁芳，鄒丹丹

(1嘉興學(xué)院附屬婦女兒童醫(yī)院，浙江嘉興 314000；2嘉興學(xué)院附屬第一醫(yī)院；3杭州佰辰醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司)

RSPO蛋白家族由4個(gè)同源蛋白組成，共享60%的序列同源性且結(jié)構(gòu)域相似，廣泛參與生物體的生長(zhǎng)發(fā)育及各項(xiàng)生命活動(dòng)[1]。已知RSPO可通過(guò)刺激富含亮氨酸重復(fù)序列的G蛋白偶聯(lián)受體(LGR)4、LGR5、LGR6來(lái)增強(qiáng)Wnt信號(hào)傳導(dǎo)[2]，Wnt信號(hào)傳導(dǎo)與肝纖維化及眾多癌癥密切相關(guān)[3,4]。此外，CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠中RSPO2表達(dá)顯著高于正常小鼠；同時(shí)RSPO2在人類纖維化肝組織中過(guò)表達(dá)，而在正常肝組織中多檢測(cè)不到[1]，但是關(guān)于RSPO2在肝纖維化發(fā)病過(guò)程中所起作用尚不明確。肝星狀細(xì)胞作為肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞之一，其激活和增生是肝纖維化發(fā)生、進(jìn)展的中心環(huán)節(jié)[5]。隨著對(duì)肝纖維化研究的不斷深入，以肝星狀細(xì)胞為切入點(diǎn)探索肝纖維化治療的新方法逐漸引起人們的興趣。本研究在前期研究RSPO2過(guò)表達(dá)會(huì)影響肝纖維化的基礎(chǔ)上[1]，以人肝星狀細(xì)胞作為研究對(duì)象，通過(guò)蛋白組學(xué)手段分析RSPO2過(guò)表達(dá)肝星狀細(xì)胞LX-2與正常LX-2細(xì)胞間的差異表達(dá)蛋白，篩選出差異表達(dá)蛋白，為進(jìn)一步研究肝纖維化發(fā)病機(jī)理、過(guò)程，以及RSPO2蛋白在肝纖維化過(guò)程中所起的作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及主要試劑、儀器 LX-2細(xì)胞購(gòu)自上海紀(jì)寧實(shí)業(yè)有限公司；293T cDNA、pcDNA3.1(-)購(gòu)自上?？殿伾锟萍加邢薰?，RPM1640培養(yǎng)基和胎牛血清、胰蛋白酶購(gòu)自Sigma-Aldrich公司，高保真聚合酶、T4 DNA 連接酶購(gòu)自Toyobo公司，膠回收試劑盒購(gòu)自Axygen公司；PCR儀、凝膠成像分析儀購(gòu)自Bio-Rad公司；Q-Exactive質(zhì)譜儀、液相色譜儀Easy nLC 1000購(gòu)自Thermo公司，RNeasy Mini kit購(gòu)于Qiangen公司。

1.2 RSPO2過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建 氨基酸序列為1-243的全長(zhǎng)-人源RSPO2基因(GeneID：340419，NM_178565.4)以293T細(xì)胞的cDNA為模板經(jīng)PCR純化所得，其PCR引物設(shè)計(jì)在5′和3′末端分別引入限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ的酶切位點(diǎn)。正向和反向引物序列如下：CCACACTGGACTAGTGGATCCATGCAGTTTCG-CCTTTTCTC和CAGCGGTTTAAACTTAAGCTTTTATTGGTTGCTCTGTCTG。純化后的PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳圖判定符合預(yù)期的核酸片斷大小，并將它與具有相同酶切的質(zhì)粒pcDNA3.1(-)連接成功后轉(zhuǎn)入Top10感受態(tài)，重組質(zhì)粒測(cè)序驗(yàn)證正確。

1.3 LX-2細(xì)胞復(fù)蘇傳代及RSPO2過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染、鑒定 LX-2細(xì)胞置于完全培養(yǎng)基(含10%FBS和雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基)，37 ℃，5%CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)。復(fù)蘇后的細(xì)胞依據(jù)其生長(zhǎng)狀態(tài)進(jìn)行傳代，一般匯合程度約達(dá)90%。取細(xì)胞以5×105接種于6孔板中，加入無(wú)雙抗的完全培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到70%～80%匯合時(shí)轉(zhuǎn)染。具體轉(zhuǎn)染步驟：100 μL無(wú)血清的RPMI1640培養(yǎng)基中分別加入重組質(zhì)粒1 200 ng，Attractene Transfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑4.5 μL，輕輕混勻。室溫孵育10 min后，用含雙抗的完全培養(yǎng)液換液，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。過(guò)表達(dá)判定：培養(yǎng)板接種細(xì)胞之前先用標(biāo)記筆在6孔板背面畫橫線標(biāo)記。將轉(zhuǎn)染RSPO2重組質(zhì)粒的LX-2設(shè)為實(shí)驗(yàn)組，消化后接入6孔板，細(xì)胞鋪滿板底，用1 mL槍頭垂直于孔板制造細(xì)胞劃痕，盡量保證各個(gè)劃痕寬度一致。吸去細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS沖洗孔板3次，洗去劃痕產(chǎn)生的細(xì)胞碎片，加入無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)基，0、12 h取出拍照，并根據(jù)收集圖片數(shù)據(jù)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。對(duì)照組細(xì)胞遷移距離為(38.8±4.3)μm，實(shí)驗(yàn)組為(69.0±6.1)μm，兩組比較，P<0.05，說(shuō)明LX-2細(xì)胞中成功地過(guò)表達(dá)了RSPO2基因。再利用RNeasy Mini kit抽提實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組總RNA，以管家基因β-actin作為內(nèi)參，對(duì)細(xì)胞總RNA進(jìn)行均一化處理，利用循環(huán)閾值(Ct值)的變化計(jì)算RSPO2基因的相對(duì)表達(dá)量。對(duì)照組RSPO2 mRNA表達(dá)水平為2.050 96E-05±8.629 88E-07，實(shí)驗(yàn)組為0.015 279±0.000 472，兩組比較，P<0.05。

1.4 RSPO2過(guò)表達(dá)的肝星狀細(xì)胞LX-2和正常LX-2細(xì)胞差異表達(dá)蛋白篩選 將實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照細(xì)胞放入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后收集兩組細(xì)胞，PBS洗3次，通過(guò)溶液內(nèi)酶解的方式制備細(xì)胞全蛋白樣本[6]，使用LC-MS/MS對(duì)細(xì)胞酶解液進(jìn)行蛋白組學(xué)分析。質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集采用數(shù)據(jù)依賴模式(DDA)，選取強(qiáng)度最高的10個(gè)母離子通過(guò)HCD碰撞打碎(NCE：30%)，分別獲得二組譜圖。質(zhì)譜采集參數(shù)為：正離子模式；毛細(xì)管電壓：2.1 kV；一級(jí)質(zhì)量范圍Mass Range：300～1 500，分辨率70000 @m/z 200；二級(jí)分辨率17 500 @ m/z 200；啟用AGC，target value 2E5；母離子選擇質(zhì)量窗口1.6 m/z。原始文件(raw)用Max Quant 1.5.2.8分析數(shù)據(jù)[7]，并用Maxquant自帶算法鑒定多肽及蛋白質(zhì)，并給出相對(duì)定量信息[8]。搜庫(kù)參數(shù)：可變修飾Variable modification： Oxidation(M)，Acetyl(Protein N-term)；固定修飾：Fixed modifications： Carbamidomethyl(C)。搜索使用的數(shù)據(jù)庫(kù)為uniprot.human.fasta(201607)，protein sequence items：92607。結(jié)果過(guò)濾參數(shù)：peptide FDR≤0.05；protein FDR≤0.05。

1.5 差異表達(dá)蛋白的生物信息學(xué)分析 對(duì)上述質(zhì)譜結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步分析，首先刪除缺失值超過(guò)60%的蛋白，再利用R語(yǔ)言的KNN算法對(duì)數(shù)據(jù)中的缺失值進(jìn)行補(bǔ)充，以組間表達(dá)差異>1.2(上調(diào))或<0.8(下調(diào)), 且P<0.05(student′st-test)為顯著差異標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)蛋白。利用生物信息學(xué)在線數(shù)據(jù)庫(kù)DAVID 6.8對(duì)篩選出的差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行功能注釋分析(GO)，得到RSPO2過(guò)表達(dá)人肝星狀細(xì)胞和正常人肝星狀細(xì)胞分別在生物過(guò)程、細(xì)胞成分和分子功能上富集的GO Term。

2 結(jié)果

2.1 RSPO2過(guò)表達(dá)LX-2細(xì)胞和正常LX-2細(xì)胞的蛋白表達(dá)質(zhì)譜 對(duì)RSPO2過(guò)表達(dá)LX-2細(xì)胞與正常LX-2細(xì)胞分別進(jìn)行3次LC-MS分析，得到6個(gè)raw data數(shù)據(jù)，共鑒定到2 423種蛋白。大多數(shù)被鑒定到的蛋白所含肽段數(shù)<10種，且蛋白數(shù)量隨著匹配的肽段數(shù)的增加主要呈現(xiàn)逐漸減少的趨勢(shì)。

2.2 RSPO2過(guò)表達(dá)LX-2細(xì)胞與正常LX-2細(xì)胞的差異表達(dá)蛋白 通過(guò)差異表達(dá)分析共獲得233個(gè)差異表達(dá)蛋白。與正常LX-2細(xì)胞比較，RSPO2過(guò)表達(dá)LX-2細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)的蛋白有115個(gè)，表達(dá)上調(diào)的蛋白有118個(gè)(P<0.05)，詳見(jiàn)表1，表1中只列出了差異較為顯著的15個(gè)高表達(dá)蛋白和15個(gè)低表達(dá)的蛋白，其中SEC62[9]、PCMT1[10]、S100A11等基因已被報(bào)道與肝癌密切相關(guān)，其他蛋白因差異不明顯且報(bào)道文章較少，故表中未列出。

2.3 RSPO2過(guò)表達(dá)LX-2細(xì)胞差異表達(dá)蛋白的功能 利用David軟件對(duì)115個(gè)低表達(dá)蛋白和118個(gè)高表達(dá)蛋白進(jìn)行GO注釋分析。這些生物學(xué)過(guò)程主要包括核轉(zhuǎn)錄mRNA分解代謝過(guò)程，無(wú)義介導(dǎo)衰變(校正P值7.62E-07)，翻譯起始(校正P值1.71E-06)，翻譯(校正P值7.27E-06)，RNA剪接(校正P值8.50E-06)，mRNA加工(校正P值7.59E-05)等，這些富集到的過(guò)程大多與RNA的轉(zhuǎn)錄與翻譯過(guò)程有關(guān)，主要分泌到細(xì)胞外，位于細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、溶酶體等位置，主要參與poly(A)RNA結(jié)合、RNA結(jié)合、核苷酸結(jié)合、核糖體結(jié)構(gòu)成分等過(guò)程。

3 討論

肝星狀細(xì)胞作為肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞之一，其持續(xù)激活是肝纖維化發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。激活的肝星狀細(xì)胞一方面通過(guò)增生和分泌細(xì)胞外基質(zhì)參與肝纖維化的形成和肝內(nèi)結(jié)構(gòu)的重建，另一方面通過(guò)細(xì)胞收縮使肝竇內(nèi)壓升高，這兩類變化最終奠定了肝纖維化、門靜脈高壓癥發(fā)病的病理學(xué)基礎(chǔ)。隨著對(duì)肝纖維化研究的不斷深入，以肝星狀細(xì)胞為切入點(diǎn)探索肝纖維化治療的新方法逐漸引起人們的興趣。

表1 RDPO2高表達(dá)人肝星狀細(xì)胞LX-2中差異表達(dá)蛋白

注：0.00*表示該蛋白在RSPO2過(guò)表達(dá)星狀細(xì)胞中不表達(dá)而在對(duì)照組中表達(dá)；∞*表示該蛋白在RSPO2過(guò)表達(dá)星狀細(xì)胞中表達(dá)而在對(duì)照組中不表達(dá)。

RSPOs蛋白家族均為分泌性蛋白，可通過(guò)激活并協(xié)同Wnt/β-catenin信號(hào)通路參與對(duì)細(xì)胞增殖和分化的調(diào)控，在腸癌、食管癌等多種疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到不可忽視的作用[11]。研究[12,13]發(fā)現(xiàn)，在人纖維化肝組織、肝纖維化小鼠模型中、特定的肝癌細(xì)胞系中均觀察到R-Spondin2的過(guò)表達(dá)。

本研究選擇人肝星狀細(xì)胞構(gòu)建RSPO2過(guò)表達(dá)細(xì)胞系，通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)確定RSPO2過(guò)表達(dá)的LX-2細(xì)胞12 h內(nèi)遷移率明顯大于對(duì)照組，表明在LX-2細(xì)胞中成功地過(guò)表達(dá)了RSPO2蛋白。隨后，研究RSPO2過(guò)表達(dá)LX-2細(xì)胞與正常LX-2細(xì)胞蛋白組學(xué)譜，獲得候選差異表達(dá)蛋白質(zhì)共計(jì)233個(gè)，其中115個(gè)蛋白質(zhì)在RSPO2過(guò)表達(dá)細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，118個(gè)表達(dá)上調(diào)，這些差異表達(dá)蛋白參與了很多與細(xì)胞轉(zhuǎn)錄、復(fù)制、增殖相關(guān)的信號(hào)通路。

在表達(dá)上調(diào)的蛋白中，S100鈣結(jié)合蛋白A11(S100A11)是S100蛋白家族中的一員，與鈣結(jié)合后蛋白構(gòu)象發(fā)生改變?cè)倥c靶蛋白結(jié)合，其主要功能是轉(zhuǎn)導(dǎo)鈣依賴性的細(xì)胞調(diào)節(jié)信號(hào)，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、炎癥發(fā)生等多種生命過(guò)程。研究[14]表明，在人角蛋白細(xì)胞內(nèi)，S100A11與腫瘤密切相關(guān)TGF-β/Smads通路有關(guān)。當(dāng)胞外鈣離子和TGF-β濃度上升時(shí)，S100A11被PKCa磷酸化并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，聯(lián)合TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子Smads，通過(guò)激活Sp1/Sp3誘導(dǎo)p21/WAF1抑制DNA合成，以表現(xiàn)出生長(zhǎng)抑制作用[15]。Smad-S100A11介導(dǎo)的通路可轉(zhuǎn)導(dǎo)高濃度TGF-β觸發(fā)的生長(zhǎng)抑制信號(hào)，即抑制S100A11蛋白活性可達(dá)到抑制TGF-β傳導(dǎo)的細(xì)胞生長(zhǎng)的信號(hào)。這一研究在人肝癌、人宮頸癌細(xì)胞中已被證實(shí)。

PCMT1也被稱為PIMT，是一種修復(fù)酶，能促使自發(fā)形成的異構(gòu)化的天冬氨酸殘基轉(zhuǎn)化成正常構(gòu)型。Dong等[16]發(fā)現(xiàn)，PCMT1蛋白表達(dá)與臨床分期，肌層浸潤(rùn)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)，生存分析顯示，PCMT1蛋白高表達(dá)是膀胱癌患者獨(dú)立的不利預(yù)后因素。體外實(shí)驗(yàn)表明，PCMT1通過(guò)調(diào)節(jié)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控膀胱癌細(xì)胞的遷移和侵襲，但對(duì)增殖沒(méi)有影響。

異源三聚體Sec61復(fù)合物和二聚體Sec62/Sec63復(fù)合物位于人內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜中，在新合成的前體肽易位到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中起到重要的作用，此外，SEC基因的突變、擴(kuò)增和過(guò)表達(dá)與各種疾病相關(guān)，包括腎臟和肝臟疾病，糖尿病和癌癥。多篇研究表明了SEC62作為頭頸癌、前列腺癌和肺癌的預(yù)后和預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物的相關(guān)性[9,17]。

在表達(dá)下調(diào)的蛋白中，TET2蛋白是一種漸進(jìn)保守的加雙氧酶，屬于TET家族3個(gè)成員之一，在去甲基化過(guò)程中將5-甲基胞嘧啶氧化為5-羥甲基胞嘧啶，從而在表觀遺傳水平上調(diào)控基因的表達(dá)[18]。研究發(fā)現(xiàn)，TET2在骨髓增殖性腫瘤[19]和骨髓增生異常綜合征[20]患者中存在突變，在骨髓增生異常綜合征中的突變率高達(dá)25%～30%。TET2的突變包括基因的缺失、插入、移碼突變等，并伴隨5-羥甲基胞嘧啶的總量的顯著減少[21]。

AIMPs家族有AIMP1、AIMP2、AIMP3三個(gè)亞型蛋。AIMP2也被稱為p38/JTV-1蛋白,是AIMPs家族三個(gè)亞型之一，參與了多種生物學(xué)功能，如細(xì)胞分化和凋亡等[22]。AIMP2是一種潛在的腫瘤抑制因子，AIMP2的剪接突變體AIMP2-DX2(缺少外顯子Exon2)與AIMP2競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合目標(biāo)蛋白，抑制了AIMP2的抗腫瘤活性，表現(xiàn)為促癌因子。抑制AIMP2-DX2可明顯抑制腫瘤細(xì)胞這一現(xiàn)象表明了AIMP2-DX2有可能成為潛在的癌癥新靶點(diǎn)。因此，AIMP2-DX2也成為目前研究的熱點(diǎn)[22～24]。Yum等[25]在小鼠模型中研究了腸內(nèi)穩(wěn)態(tài)和腫瘤發(fā)生的AIMP2和Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)之間的關(guān)系，并發(fā)現(xiàn)AIMP2能結(jié)合到Wnt/β-catenin信號(hào)通路重要的組成成分DVL上，從而抑制了DVL與AXIN的相互作用，此外AIMP2是通過(guò)以Aimp2基因劑量依賴性方式抑制Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)抑制腸類器官的形成和生長(zhǎng)，低表達(dá)的AIMP2可能降低了對(duì)Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)的抑制作用，從而導(dǎo)致細(xì)胞的代謝異常。與正常LX-2組比較，過(guò)表達(dá)RSPO2的LX-2蛋白組AIMP2表達(dá)顯著降低。

總之，通過(guò)蛋白組學(xué)方法篩選出與肝臟相關(guān)疾病的差異表達(dá)蛋白，可能作為潛在的生物學(xué)靶點(diǎn)，并為RSPO2介導(dǎo)的肝纖維化過(guò)程的研究提供了更多的研究資料。目前的工作還需后續(xù)相關(guān)工作進(jìn)一步鑒定和驗(yàn)證。